Vorbereitung des Mgm101 Rekombinationsprotein von MBP-based Tagging-Strategie
Summary
Die Hefe-Mitochondrien nucleoid Protein, Mgm101, ist ein Rad52-Typ Rekombinationsprotein die große oligomere Ringe bildet. Ein Protokoll wird beschrieben, dass lösliches rekombinantes Mgm101 vorzubereiten mit dem Maltose Binding Protein (MBP)-Tagging-Strategie mit Kationenaustausch und Größenausschlusschromatographie gekoppelt.
Abstract
Die MGM101 Gen wurde vor 20 Jahren für seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA identifiziert. Studien aus mehreren Gruppen haben vorgeschlagen, dass das Protein in der Mgm101 recombinational Reparatur der mitochondrialen DNA beteiligt ist. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass Mgm101 der Rad52-Typ Rekombinationsprotein Familie verwandt ist. Diese Proteine bilden große oligomere Ringe und fördern die Anlagerung homologen einzelne DNA-Moleküle. Allerdings hat die Charakterisierung von Mgm101 der Schwierigkeit bei der Herstellung des rekombinanten Proteins behindert. Hier wird ein zuverlässiges Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Mgm101 beschrieben. Maltose Binding Protein (MBP)-markierten Mgm101 zunächst in Escherichia coli exprimiert. Das Fusionsprotein wird zunächst durch Amylose-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach der Begrüßung durch proteolytische Spaltung freigesetzt wird Mgm101 von MBP durch Kationenaustauschchromatographieschritt getrennt. Monodispersen Mgm101 erhält danndurch Größenausschlusschromatographie. Eine Ausbeute von ~ 0,87 mg Mgm101 pro Liter Bakterienkultur kann routinemäßig erhalten. Das rekombinante Mgm101 eine minimale Verunreinigung der DNA. Die vorbereiteten Proben werden erfolgreich für biochemische, strukturelle und Single Particle-Image-Analysen von Mgm101 verwendet. Dieses Protokoll kann auch zur Herstellung von anderen großen oligomere DNA-bindende Proteine falsch gefaltet und giftig für Bakterienzellen verwendet werden.
Introduction
Homologe Rekombination ist für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) und Interstrang Vernetzungen und für die Wiederaufnahme der DNA-Replikation von eingestürzten Replikationsgabeln 1 wichtig. In konventionellen homologen Rekombination ist die zentrale Reaktion der ATP-abhängigen Rekombinasen wie RecA in Prokaryoten und Rad51 und Dmc1 in Eukaryonten 1-3 katalysiert wird. Diese Rekombinase bilden nucleoprotein Filamente auf ssDNA, die unerlässlich für die Einleitung Homologiesuche und Stranginvasion innerhalb duplex DNA-Templates (Abbildung 1, links) 4-7 sind. Zusätzlich zu den herkömmlichen Schema kann homologe Rekombination auch in einer Weise RecA/Rad51-independent (Abbildung 1, rechts). Zum Beispiel kann die Hefe Rad52 und Rad59 Proteine direkt katalysieren die Anlagerung komplementäre ssDNA-Stränge, die durch Resektion von dsDNA Unterbrechungen ausgesetzt sind. Diese Rekombination Prozess, da singen bekanntle Banddurchlaufanlagen, hat in der Regel nicht um homologe Paarung mit dsDNA Vorlagen. Nach dem Glühen werden heterologe Schwänze durch Exonucleasen entfernt und Kerben sind ligiert Genom Kontinuität 8-10 wiederherzustellen. Reparatur durch den einzigen Banddurchlaufanlagen Mechanismus wird oft durch Deletionen von genomischen Sequenzen zwischen direkt wiederholt Regionen begleitet.
Rad52 gehört zu einer vielfältigen Gruppe von Proteinen, die Rekombination verbreitet unter 11 Bakteriophagen sind. Diese Proteine sind auch als Single Strand Annealing Proteine (SSAPs) bekannt, auf der Grundlage ihrer Aktivität in der Förderung der Anlagerung homologen einzelsträngige DNA-Moleküle. Die am besten charakterisierten Bakteriophagen SSAPs sind Redβ und Erf vom Bakteriophagen λ und P22, RecT vom Prophagen rac und der Sak-Protein aus der Lactococcus-Phagen UL36. Die SSAPs sind strukturell durch eine typische β-β-β-α fach dadurch, obwohl Ähnlichkeit praktisch Nichterfassungssignal wirdkönnen in ihrer primären Sequenzen. Sie alle bilden große homooligomeren Ringe von 10 – 14 fache Symmetrie in vitro 12-14. Die funktionellen Auswirkungen dieser Eigenschaft höherer Ordnung strukturelle Organisation ist nicht gut verstanden.
Wir sind daran interessiert, zu verstehen, den Mechanismus der homologen Rekombination in der mitochondrialen Genoms. Wir haben zuvor die MGM101 Gen, das für die Aufrechterhaltung der mtDNA in Saccharomyces cerevisiae 15 identifiziert. MGM101 anschließend wurde festgestellt, dass mitochondriale Nukleoide an und ist für die Toleranz der mtDNA auf DNA-schädigende Mittel 16 erforderlich. Allerdings wurde in der Studie von Mgm101 wurde zurück in den letzten zehn Jahren durch die Schwierigkeit gehalten rekombinanten Mgm101 erzeugen. Wir haben vor kurzem in der Herstellung von löslichen Mgm101 bei großen Mengen aus E. gelungen coli mit dem MBP-Fusion-Strategie. Dies hat es uns ermöglicht, dass Mgm101 Aktien demonstrierenbiochemische und strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Rad52-Familie von Proteinen 17,18. In diesem Bericht wird eine dreistufige Reinigungsverfahren beschrieben, die produziert homogene Mgm101for biochemische und strukturelle Analysen (Abbildung 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Es war eine Herausforderung, um eine stabile, nativen rekombinanten Protein aus E. Mgm101 produzieren coli möglicherweise aufgrund seiner Unlöslichkeit in Bakterienzellen. In diesem Bericht zeigen wir, dass die MBP-Fusion-Strategie das Protein zu einem angemessen hohen Niveau exprimiert werden können. Durch negative Färbung Transmissionselektronenmikroskopie und Größenausschlusschromatographie, haben wir bereits gezeigt, dass die MBP-Fusionsprotein einheitliche Oligomere bildet in vitro …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Stephan Wilkens für Hilfe in Transmissions-Elektronenmikroskopie. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01AG023731 unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
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