Preparação do Mgm101 recombinação de proteínas por Estratégia Tagging baseado MBP
Summary
A proteína de levedura nucleóide mitocondrial, Mgm101, é uma proteína de recombinação de tipo rad52 que forma anéis grandes oligoméricas. Um protocolo é descrito para preparar Mgm101 solúvel recombinante utilizando a proteína de ligação à maltose (MBP), acoplado com a estratégia de marcação de permuta catiónica e a cromatografia de exclusão de tamanho.
Abstract
O gene foi identificado MGM101 há 20 anos pelo seu papel na manutenção do DNA mitocondrial. Estudos realizados em vários grupos têm sugerido que a proteína Mgm101 está envolvida na reparação de recombinação do DNA mitocondrial. Investigações recentes têm indicado que Mgm101 está relacionado com a família de proteínas do tipo de recombinação de RAD52. Estas proteínas formam anéis grandes oligómeros e promover a hibridação de moléculas de homólogo de ADN de cadeia simples. No entanto, a caracterização das Mgm101 tem sido dificultada pela dificuldade em produzir a proteína recombinante. Aqui, um processo de confiança para a preparação de proteínas recombinantes é descrita Mgm101. Maltose Binding Protein (MBP), marcado Mgm101 é expressa pela primeira vez em Escherichia coli. A proteína de fusão é inicialmente purificado por cromatografia de afinidade em amilose. Depois de ser libertado por clivagem proteolítica, Mgm101 é separada por cromatografia de troca PAM catiónica. Monodispersas Mgm101 é então obtidopor cromatografia de exclusão de tamanho. Um rendimento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultura bacteriana pode ser rotineiramente obtidos. O Mgm101 recombinante tem o mínimo de contaminação de ADN. As amostras preparadas são utilizadas com sucesso para a análise da imagem de partículas bioquímicos, estruturais e de Mgm101 único. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a preparação de outros grandes proteínas de ligação de ADN oligoméricas que podem ser deformadas e tóxico para as células bacterianas.
Introduction
A recombinação homóloga é importante para a reparação de quebras de cadeia dupla (DSB) e reticulações intercadeias, e para a re-introdução de garfos de replicação de ADN de replicação colapsadas 1. Na recombinação homóloga convencional, a reacção é catalisada pela central, as recombinases dependentes de ATP, incluindo RecA em procariotas, e Rad51 e Dmc1 em eucariotas 1-3. Estas recombinases formar filamentos nucleoprotéicos em ADNcs, que são essenciais para iniciar a pesquisa de homologia e invasão vertente dúplex dentro de moldes de ADN (Figura 1, painel da esquerda) 4-7. Além do esquema convencional, a recombinação homóloga pode também ocorrer de uma forma RecA/Rad51-independent (Figura 1, painel da direita). Por exemplo, a levedura RAD52 e Rad59 proteínas podem catalisar directamente o recozimento de cordões ssDNA complementares que são expostos por ressecção de dsDNA quebras. Este processo de recombinação, conhecido como cantarle vertente recozimento, geralmente não envolve o emparelhamento homólogo com modelos dsDNA. Após o recozimento, caudas heterólogos são removidos por exonucleases e entalhes são ligados para restaurar a continuidade do genoma 8-10. Reparação pelo único mecanismo de recozimento vertente é muitas vezes acompanhada de exclusões de seqüências genômicas entre as regiões diretamente repetidas.
Rad52 pertence a um grupo diverso de proteínas de recombinação que são comuns entre os bacteriófagos 11. Estas proteínas são também conhecidos como fio único Proteínas de recozimento (SSAPs), com base na sua actividade na promoção da hibridação de moléculas de homólogo de ADN de cadeia simples. Os melhores SSAPs bacteriófagos são caracterizadas e redp Erf do bacteriófagos λ e P22, RecT do profago rac Sak e a proteína do fago Lactococcus ul36. Os SSAPs são estruturalmente caracterizados por uma dobra β-β-β-α típico, apesar de similaridade é virtualmente indetectávelpoder em suas seqüências primárias. Todos eles formam grandes anéis de homo-oligoméricas de 10-14 simetria vezes in vitro 12-14. As implicações funcionais desta organização estrutural de ordem superior característica não é bem compreendida.
Estamos interessados em compreender o mecanismo de recombinação homóloga no genoma mitocondrial. Foram identificadas anteriormente MGM101 o gene que é essencial para a manutenção de mtDNA em Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 foi posteriormente se verificou estar associada com nucleoids mitocondriais e é necessário para a tolerância de mtDNA com agentes prejudiciais de ADN 16. No entanto, o estudo da Mgm101 foi retido na última década pela dificuldade de produzir Mgm101 recombinante. Recentemente, conseguiu produzir Mgm101 solúvel em grandes quantidades a partir de E. coli utilizando a estratégia de fusão MBP. Isso nos permitiu demonstrar que Mgm101 açõessemelhanças bioquímicas e estruturais com o rad52-família de proteínas 17,18. Neste relatório, um procedimento de purificação de três passos é descrito, que produz Mgm101for análises bioquímicas e estruturais homogéneos (Figura 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Foi um desafio para a produção de um estábulo, nativo da proteína recombinante a partir de E. Mgm101 coli, possivelmente devido à sua insolubilidade em células bacterianas. Neste relatório, que mostram que a estratégia de fusão MBP-permite que a proteína seja expressa com um nível razoavelmente elevado. Por meio da coloração de microscopia electrónica de transmissão negativo e cromatografia de exclusão de tamanho, mostrámos previamente que a proteína de fusão MBP-forma oligómeros un…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Stephan Wilkens ajuda para microscopia eletrônica de transmissão. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant R01AG023731.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
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