Preparación de la proteína de recombinación Mgm101 por Estrategia de etiquetas MBP basado
Summary
La proteína nucleoide mitocondrial de levadura, Mgm101, es una proteína de recombinación de tipo Rad52 que forma grandes anillos de oligómeros. Un protocolo se describe la preparación Mgm101 recombinante soluble usando la proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetado estrategia junto con intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño.
Abstract
El gen MGM101 se identificó hace 20 años por su papel en el mantenimiento de ADN mitocondrial. Los estudios de varios grupos han sugerido que la proteína Mgm101 está implicado en la reparación de recombinación de ADN mitocondrial. Recientes investigaciones han indicado que Mgm101 se relaciona con la familia de proteínas de recombinación de tipo Rad52. Estas proteínas forman grandes anillos de oligómeros y promueven la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Sin embargo, la caracterización de Mgm101 se ha visto obstaculizada por la dificultad en la producción de la proteína recombinante. Aquí, se describe un procedimiento fiable para la preparación de Mgm101 recombinante. Proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetados Mgm101 se expresa primero en Escherichia coli. La proteína de fusión se purificó inicialmente por cromatografía de afinidad de amilosa. Después de ser liberado por escisión proteolítica, Mgm101 se separa de MBP por cromatografía de intercambio catiónico. Monodispersada Mgm101 se obtiene despuéspor cromatografía de exclusión por tamaño. Se obtiene un rendimiento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultivo bacteriano puede ser obtenido de forma rutinaria. El Mgm101 recombinante tiene un mínimo de contaminación de ADN. Las muestras preparadas se utilizan con éxito para el análisis de imágenes de partículas bioquímicas, estructurales e individuales de Mgm101. Este protocolo también se puede usar para la preparación de otras proteínas de unión al ADN oligoméricas grandes que pueden ser mal plegadas y tóxico para las células bacterianas.
Introduction
La recombinación homóloga es importante para la reparación de doble filamento se rompe (DSBs) y enlaces cruzados, y para la reiniciación de la replicación del ADN a partir de horquillas de replicación se derrumbó 1. En la recombinación homóloga convencional, el centro de reacción es catalizada por las recombinasas dependientes de ATP incluyendo RecA en procariotas, y Rad51 y Dmc1 en eucariotas 1-3. Estas recombinaciones forman nucleoprotein filamentos en ssDNA, que son esenciales para iniciar la búsqueda de homología y el capítulo invasión dentro de moldes de ADN dúplex (Figura 1, panel izquierdo) 4-7. Además del esquema convencional, la recombinación homóloga también puede tener lugar de una manera RecA/Rad51-independent (Figura 1, panel derecho). Por ejemplo, las proteínas de levadura Rad52 y Rad59 pueden catalizar directamente la hibridación de cadenas de ADNmc complementarias que están expuestos por resección de roturas de ADN de doble cadena. Este proceso de recombinación, conocido como cantarle línea de recocido, por lo general no implica homóloga de emparejamiento con las plantillas de ADN de doble cadena. Después del recocido, colas heterólogas se eliminan por exonucleasas y mellas se ligan para restaurar la continuidad del genoma 8-10. Reparación por el mismo mecanismo de recocido capítulo suele ir acompañada de las supresiones de secuencias genómicas entre las regiones directamente repetidas.
Rad52 pertenece a un grupo diverso de proteínas de recombinación que son muy extendida entre bacteriófagos 11. Estas proteínas también se conocen como proteínas individuales de recocido Strand (SSAP), sobre la base de su actividad en la promoción de la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Los mejores SSAP bacteriófagos son caracterizados Redβ y Erf del bacteriófagos λ y P22, RecT del profago rac y la proteína Sak del fago lactococcal UL36. Los SSAP se caracterizan estructuralmente por un típico pliegue β-β-β-α, aunque similitud es prácticamente indetectablepoder en sus secuencias primarias. Todos ellos forman grandes anillos homo-oligómeros de 10-14 simetría veces in vitro 12-14. Las consecuencias funcionales de la organización estructural de orden superior característica no se entiende bien.
Estamos interesados en la comprensión del mecanismo de la recombinación homóloga en el genoma mitocondrial. Anteriormente hemos identificado el gen MGM101 que es esencial para el mantenimiento de ADNmt en Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 posteriormente se encontró que se asocia con nucleoides mitocondriales y es necesario para la tolerancia de ADNmt a los agentes que dañan el ADN 16. Sin embargo, el estudio de Mgm101 ha sido muy limitado en la última década por la dificultad para producir Mgm101 recombinante. Hemos tenido éxito recientemente en la producción de Mgm101 soluble en grandes cantidades a partir de E. coli mediante la estrategia de fusión MBP. Esto nos ha permitido demostrar que Mgm101 accionessimilitudes bioquímicas y estructurales con la Rad52-familia de proteínas 17,18. En este informe, se describe un procedimiento de purificación de tres etapas, que produce los análisis bioquímicos y estructurales Mgm101for homogéneos (Figura 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ha sido un reto para producir una proteína estable, nativo recombinante Mgm101 de E. coli posiblemente debido a su insolubilidad en células bacterianas. En este informe, muestran que la estrategia de fusión MBP permite que la proteína que se expresa en un nivel razonablemente alto. Mediante el uso de tinción negativa microscopía electrónica de transmisión y cromatografía de exclusión por tamaño, hemos demostrado previamente que la proteína de fusión MBP forma oligómeros uniformes in vitro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Stephan Wilkens para la ayuda en la microscopía electrónica de transmisión. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la concesión R01AG023731 Salud.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
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