הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP
Summary
חלבון שמרי המיטוכונדריה nucleoid, Mgm101, הוא חלבון רקומבינציה Rad52 מסוג שיוצר טבעות oligomeric גדולות. פרוטוקול מתואר להכין Mgm101 רקומביננטי המסיס באמצעות חלבון מחייב מלטוז (MBP) תיוג אסטרטגיה בשילוב עם חילופי קטיון וכרומטוגרפיה הדרת גודל.
Abstract
גן MGM101 זוהה לפני 20 שנים לתפקידה בשמירה על ה-DNA של המיטוכונדריה. מחקרים ממספר קבוצות הראו כי חלבון Mgm101 מעורב בתיקון recombinational של ה-DNA המיטוכונדרי. חקירות שנעשו לאחרונה הצביעו על כך שMgm101 קשורה למשפחת חלבוני רקומבינציה Rad52 הסוג. חלבונים אלה יוצרים טבעות oligomeric גדולות ולקדם את חישול של מולקולות DNA גדילים הומולוגיים יחידה. עם זאת, האפיון של Mgm101 התעכב בשל הקושי בייצור חלבון רקומביננטי. כאן, הליך אמין להכנת רקומביננטי Mgm101 מתואר. חלבון המחייב מלטוז (MBP) מתויג Mgm101 בא לידי ביטוי הראשון בEscherichia coli. חלבון ההיתוך הוא מטוהרים בתחילה על ידי amylose זיקת כרומטוגרפיה. לאחר ששוחרר על ידי מחשוף פרוטאוליטי, Mgm101 מופרד מMBP ידי כרומטוגרפיה חילופי קטיוני. Monodispersed Mgm101 אז מתקבלעל ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל. תשואה של 0.87 מ"ג של ~ Mgm101 לליטר תרבות חיידקים יכולה להיות שהושגה באופן שגרתי. יש Mgm101 רקומביננטי זיהום מינימאלי של ה-DNA. הדגימות המוכנות משמשות בהצלחה לניתוחי תמונת חלקיקים ביוכימיים, מבניים ואחת של Mgm101. פרוטוקול זה יכול לשמש גם להכנת חלבונים שעשויים להיות misfolded ורעיל לתאי חיידקי ה-DNA מחייב oligomeric גדולים אחרים.
Introduction
הומולוגי רקומבינציה היא חשובה לתיקון של הפסקות פעמי גדיל (DSBs) וinterstrand crosslinks, ולreinitiation של שכפול הדנ"א ממזלגות שכפול התמוטטו 1. בקונבנציונלי הומולוגית רקומבינציה, התגובה המרכזית היא catalyzed ידי recombinases ATP התלויים בי RecA בפרוקריוטים, וRAD51 וDmc1 אאוקריוטים 1-3. recombinases אלה יוצרים סיבי nucleoprotein על ssDNA, שהם חיוניים לייזום חיפוש הומולוגיה ופלישה גדיל DNA בתוך תבניות דופלקס (איור 1, פנל משמאל) 4-7. בנוסף לערכה הרגילה, הומולוגית רקומבינציה יכולה להתבצע גם באופן RecA/Rad51-independent (איור 1, פנל מימין). לדוגמה, את Rad52 וRad59 חלבוני שמרים ישירות יכולים לזרז חישול של גדילי ssDNA משלימים אשר נחשפו על ידי resectioning הפסקות dsDNA. תהליך רקומבינציה זה, המכונה לשירגדיל le חישול, בדרך כלל אינו כרוך הומולוגי זיווג עם תבניות dsDNA. לאחר חישול, זנבות Heterologous יוסרו על ידי exonucleases וניקס היא ligated לשחזר 8-10 המשכיות הגנום. תיקון על ידי מנגנון חישול הגדיל הבודד מלווה לעתים קרובות על ידי מחיקות של רצפים גנטיים בין אזורים ישירות חוזרים ונשנים.
Rad52 שייך לקבוצה מגוונת של חלבוני רקומבינציה כי הם נפוצים בקרב bacteriophages 11. חלבונים אלו ידועים גם כחישול חלבונים גדיל בודד (SSAPs), המבוססים על פעילותם בקידום חישול של מולקולות DNA גדילים הומולוגיים יחידה. את SSAPs bacteriophage אפיין הטוב ביותר הם Redβ וERF מbacteriophages λ וP22, RECT מRAC prophage וחלבון סאק מהפאג lactococcal ul36. את SSAPs מאופיין מבני על ידי קיפול β-β-β-α טיפוסי, אם כי דמיון הוא כמעט undetectתוכל ברצפים העיקריים שלהם. הם כל צורת הטבעות גדולות הומו-oligomeric של 10 – פי הסימטריה 14 במבחנה 12-14. ההשלכות התפקודיות של ארגון זה אופייני גבוה סדר מבני אינה מובנות היטב.
אנחנו מעוניינים בהבנת המנגנון של רקומבינציה הומולוגית בגנום המיטוכונדריה. אנחנו זיהינו בעבר את גן MGM101 כי הוא חיוני לשמירה על mtDNA בSaccharomyces cerevisiae 15. MGM101 מכן היה נמצא קשור עם nucleoids המיטוכונדריה והוא נדרש לסובלנות של mtDNA לסוכני ה-DNA נזק 16. עם זאת, המחקר של Mgm101 כבר התאפק בעשור האחרון על ידי הקושי לייצר Mgm101 רקומביננטי. הצלחנו לאחרונה בהפקת Mgm101 המסיס בכמויות גדולות מא coli באמצעות אסטרטגית MBP-Fusion. זה אפשר לנו להוכיח כי Mgm101 מניותדמיון מבני וביוכימיים עם Rad52 למשפחה של חלבוני 17,18. בדו"ח זה, הליך טיהור שלושה שלבים מתואר, המייצר ניתוחים ביוכימיים ומבניים Mgm101for הומוגניות (איור 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
זה כבר אתגר לייצר, Mgm101 חלבון רקומביננטי יליד יציב מא coli אולי בשל insolubility בתאי חיידקים. בדו"ח זה, אנו מציגים את אסטרטגית MBP-המאפשרת היתוך החלבון לבוא לידי ביטוי ברמה גבוהה למדי. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים שליליים מכתים וכרומטוגרפיה הדרת גודל, יש לנו הרא?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Wilkens סטפן לעזרה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט R01AG023731.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
- Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
- Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
- Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
- Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
- Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
- Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Génétique. 153, 1117-1130 (1999).
- Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
- Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
- Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
- Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
- Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
- Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
- Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
- Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
- Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
- Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
- Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
- Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
- Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).
