MBP आधारित टैगिंग रणनीति से Mgm101 पुनर्संयोजन प्रोटीन की तैयारी
Summary
खमीर मितोचोन्द्रिअल nucleoid प्रोटीन, Mgm101, बड़े oligomeric छल्ले कि रूपों एक Rad52 प्रकार पुनर्संयोजन प्रोटीन है. एक प्रोटोकॉल माल्टोस बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) टैगिंग कटियन विनिमय और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ मिलकर रणनीति का प्रयोग घुलनशील पुनः संयोजक Mgm101 तैयार करने के लिए वर्णित है.
Abstract
MGM101 जीन mitochondrial डीएनए के रखरखाव में अपनी भूमिका के लिए 20 साल पहले की पहचान की थी. कई समूहों से अध्ययन Mgm101 प्रोटीन mitochondrial डीएनए के recombinational मरम्मत में शामिल है कि सुझाव दिया है. हाल ही में जांच Mgm101 Rad52 प्रकार पुनर्संयोजन प्रोटीन परिवार से संबंधित है कि संकेत दिया है. ये प्रोटीन बड़े oligomeric के छल्ले के रूप में और मुताबिक़ एकल असहाय डीएनए अणु की annealing बढ़ावा. हालांकि, Mgm101 के लक्षण वर्णन पुनः संयोजक प्रोटीन का निर्माण करने में कठिनाई द्वारा बाधा कर दिया गया है. इधर, पुनः संयोजक Mgm101 की तैयारी के लिए एक विश्वसनीय प्रक्रिया में वर्णित है. Maltose बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) टैग Mgm101 पहले Escherichia कोलाई में व्यक्त किया है. संलयन प्रोटीन शुरू में एमाइलोज आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध होता है. Proteolytic दरार से रिहा होने के बाद, Mgm101 धनायनित विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा MBP से अलग किया जाता है. Monodispersed Mgm101 तो प्राप्त की हैआकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा. जीवाणु संस्कृति के प्रति लीटर Mgm101 की ~ 0.87 मिलीग्राम की एक उपज नियमित रूप से प्राप्त किया जा सकता है. पुनः संयोजक Mgm101 डीएनए की न्यूनतम संदूषण है. तैयार नमूने सफलतापूर्वक Mgm101 की, जैव रासायनिक संरचनात्मक और एक कण छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल भी misfolded और बैक्टीरियल कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है कि अन्य बड़े oligomeric डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
मुताबिक़ पुनर्संयोजन डबल भूग्रस्त टूटता है की मरम्मत (DSBs) और interstrand crosslinks, के लिए और ढह प्रतिकृति कांटे 1 से डीएनए प्रतिकृति के reinitiation के लिए महत्वपूर्ण है. पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन में, केंद्रीय प्रतिक्रिया प्रोकीर्योट्स में RECA, और RAD51 और 1-3 eukaryotes में Dmc1 सहित एटीपी निर्भर recombinases द्वारा उत्प्रेरित है. ये recombinases द्वैध डीएनए टेम्पलेट (चित्रा 1, बाएं पैनल) 4-7 भीतर अनुरूपता खोज और किनारा आक्रमण की शुरुआत करने के लिए आवश्यक हैं जो ssDNA, पर nucleoprotein तंतु के रूप में. पारंपरिक योजना के अलावा, मुताबिक़ पुनर्संयोजन भी एक RecA/Rad51-independent तरीके से (चित्रा 1, सही पैनल) में जगह नहीं ले सकता. उदाहरण के लिए, खमीर Rad52 और Rad59 प्रोटीन सीधे dsDNA टूट की resectioning से सामने आ रहे हैं जो पूरक ssDNA किस्में annealing उत्प्रेरित कर सकते हैं. गाने के रूप में जाना जाता है यह पुनर्संयोजन प्रक्रिया,ले किनारा annealing, आम तौर पर मुताबिक़ dsDNA टेम्पलेट्स के साथ जोड़ी को शामिल नहीं करता. Annealing के बाद, heterologous पूंछ exonucleases से हटा रहे हैं और nicks जीनोम निरंतरता 8-10 बहाल करने के लिए ligated हैं. भी कतरा annealing तंत्र द्वारा मरम्मत अक्सर सीधे दोहराया क्षेत्रों के बीच जीनोमिक दृश्यों के विलोपन के साथ है.
Rad52 bacteriophages 11 के बीच व्यापक हैं कि पुनर्संयोजन प्रोटीन की एक विविध समूह के अंतर्गत आता है. ये प्रोटीन भी मुताबिक़ एकल असहाय डीएनए अणु की annealing को बढ़ावा देने में उनकी गतिविधियों के आधार पर भी कतरा एनीलिंग प्रोटीन (SSAPs) के रूप में जाना जाता है. सर्वश्रेष्ठ विशेषता जीवाणुभोजी SSAPs Redβ और lactococcal फेज ul36 से prophage आरएसी और Sak प्रोटीन से bacteriophages λ और P22, रंगरूट से ERF हैं. समानता लगभग undetect है हालांकि SSAPs संरचनात्मक रूप से, एक ठेठ β-β-β-α गुना की विशेषता हैउनकी प्राथमिक दृश्यों में सक्षम. 10 की वे सभी फार्म बड़े होमोसेक्सुअल oligomeric छल्ले – विट्रो 12-14 में 14 गुना समरूपता. इस विशेषता उच्च आदेश संरचनात्मक संगठन के कार्यात्मक प्रभाव अच्छी तरह से नहीं समझा गया है.
हम mitochondrial जीनोम में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के तंत्र को समझने में रुचि रखते हैं. हम पहले से Saccharomyces cerevisiae 15 में mtDNA के रखरखाव के लिए आवश्यक है कि MGM101 जीन की पहचान की है. MGM101 बाद मितोचोन्द्रिअल nucleoids साथ जुड़ा होना पाया गया था और डीएनए हानिकारक एजेंटों के लिए mtDNA की सहिष्णुता 16 के लिए आवश्यक है. हालांकि, Mgm101 का अध्ययन पुनः संयोजक Mgm101 निर्माण करने के लिए कठिनाई से पिछले एक दशक में वापस आयोजित किया गया है. हमने हाल ही में ई. से बड़ी मात्रा में घुलनशील Mgm101 का निर्माण करने में सफल रहा है इस MBP-संलयन रणनीति का प्रयोग कोलाई. यह हमें उस Mgm101 शेयरों का प्रदर्शन करने के लिए सक्षम हैप्रोटीन 17,18 के Rad52 परिवार के साथ जैव रासायनिक और संरचनात्मक समानता. इस रिपोर्ट में, एक तीन कदम शोधन प्रक्रिया सजातीय Mgm101for जैव रासायनिक और संरचनात्मक विश्लेषण (चित्रा 2) पैदा करता है, जो वर्णन किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह ई. से एक स्थिर, देशी पुनः संयोजक Mgm101 प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक चुनौती रहा है बैक्टीरियल कोशिकाओं में इसकी जटिलता को संभवतः कारण कोलाई. इस रिपोर्ट में, हम इस MBP-संलयन रणनीति प्रोटीन एक काफी…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में मदद के लिए स्टीफन Wilkens धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य अनुदान R01AG023731 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
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