MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製
Summary
酵母ミトコンドリア核様体タンパク質、Mgm101は、大きなオリゴマーの環を形成するRAD52型組換えタンパク質である。プロトコルは、陽イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーと連結マルトース結合タンパク質（MBP）タギング方式を使用して可溶性組換えMgm101を調製するために記載されている。
Abstract
MGM101遺伝子はミトコンドリアDNAの維持におけるその役割のために20年前に同定された。いくつかのグループからの研究がMgm101タンパク質は、ミトコンドリアDNAの組換え修復に関与することが示唆されている。最近の研究は、Mgm101がRAD52型組換えタンパク質ファミリーに関連することが示されている。これらのタンパク質は、大きなオリゴマーの環を形成し、相同な一本鎖DNA分子のアニーリングを促進する。しかし、Mgm101の特徴は、組換えタンパク質を産生することが困難によって妨げられてきた。ここでは、組換えMgm101の調製のための信頼性のある手順を説明する。マルトース結合タンパク質（MBP）タグ付きMgm101は、第大腸菌で発現される。融合タンパク質は、最初アミロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。タンパク質分解切断によって放出された後、Mgm101は、陽イオン交換クロマトグラフィーによってMBPから分離される。単分散Mgm101その後、得られたサイズ排除クロマトグラフィーによる。細菌培養のリットルあたりMgm101の〜0.87ミリグラムの収量は日常的に得ることができる。換えMgm101は、DNAの最小の汚染されています。調製したサンプルが正常にMgm101の、生化学的構造及び単粒子像分析のために使用される。このプロトコルは、ミスフォールドおよび細菌細胞に対して毒性することができる他の大きなオリゴマーDNA結合タンパク質の調製のために使用することができる。
Introduction
相同組換えは、二本鎖切断（DSBの）と鎖間架橋の修復のための、および縮小複製フォーク1からDNA複製の再開始のために重要である。従来の相同組換えでは、中央の反応は、原核生物においてRecAタンパク質、及びRad51の1-3および真核生物におけるDMC1含むATP依存性リコンビナーゼにより触媒される。これらのリコンビナーゼは、二本鎖DNAテンプレート（ 図1、左パネル）4-7内の相同性検索と鎖侵入を開始するために不可欠である一本鎖DNA上で核タンパク質フィラメントを形成。従来方式に加えて、相同組換えはまたRecA/Rad51-independent方法（ 図1、右パネル）で行うことができる。例えば、酵母RAD52とRad59タンパク質は直接二本鎖DNA切断の切除によって公開され、相補鎖DNA鎖のアニーリングを触媒することができます。歌うと呼ばれるこの再結合過程、ル鎖がアニーリング、一般的に相同な二本鎖DNAテンプレートとのペアリングは含まれません。アニール後、異種尾はエキソヌクレアーゼとニックゲノム継続8-10を復元するために連結されることにより除去される。一本鎖アニーリング機構により修復は、しばしば直接繰り返さ地域間のゲノム配列の欠失を伴っている。
RAD52はバクテリオ11の間で普及している組換えタンパク質の多様なグループに属しています。これらのタンパク質はまた、相同な一本鎖DNA分子のアニーリングを促進するそれらの活性に基づいて、一本鎖アニーリングタンパク質（SSAPs）として知られている。最高の特徴バクテリオファージSSAPsはRedβとラクトコッカスファージul36からプロファージRACおよびサックタンパク質からバクテリオファージλとP22、RecTをからErfにある。類似性が事実上undetectですがSSAPsは、構造的、典型的なβ-β-β-α倍によって特徴付けられる彼らの主要なシーケンスでできる。 10彼らは、すべてのフォーム大ホモオリゴマーリング- 体外 12-14 で 14回対称。この特徴的な高次構造、組織の機能的な意味はよく理解されていない。
私たちは、ミトコンドリアゲノムに相同組換えのメカニズムを理解することに興味を持っています。我々は以前に、サッカロミセス·セレビシエ 15内のmtDNAの維持に必須であるMGM101遺伝子を同定した。MGM101は 、その後、ミトコンドリア核様体と関連することが見出され、DNA損傷剤に対するミトコンドリアの許容16に必要とされる。しかし、Mgm101の研究は、組換えMgm101を生産する難しさによって10年で戻って開催されています。我々は最近、E.から大量に可溶Mgm101を生産することに成功しましたMBP融合戦略を使用して大腸菌 。これは、Mgm101株式を発揮することができましたタンパク質17,18のRAD52-家族と生化学的および構造的類似性。本報告では、三段階精製法は均質Mgm101for生化学的および構造解析します（ 図2）を生成し、これに記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
これは、Eから安定した、ネイティブ換えMgm101タンパク質を産生するために課題となっている細菌細胞におけるその不溶性が原因の可能性大腸菌 。本稿では、MBP融合戦略はタンパク質が適度に高いレベルで発現されることができることを示している。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、我々は以前にMBP-融合タンパク質は、インビ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、透過型電子顕微鏡で助けステファンウィルキンスに感謝。この作品は、健康グラントR01AG023731の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
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