Tilberedning av Mgm101 rekombinasjon Protein av MBP-baserte Tagging Strategi
Summary
Gjæren mitokondrie nucleoid protein, Mgm101, er en Rad52-type rekombinasjon protein som danner store oligomeric ringer. En protokoll er beskrevet å forberede løselig rekombinant Mgm101 bruke maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategi kombinert med kationebytter og størrelse utelukkelse kromatografi.
Abstract
Den MGM101 genet ble identifisert 20 år siden for sin rolle i opprettholdelsen av mitokondrie-DNA. Studier fra flere grupper har antydet at Mgm101 protein er involvert i recombinational reparasjon av mitokondrie-DNA. Nylige undersøkelser har indikert at Mgm101 er relatert til Rad52-type rekombinasjon protein family. Disse proteinene danner store oligomere ringene og fremme annealing av homolog enkelttrådet DNA-molekyler. Imidlertid har karakterisering av Mgm101 blitt hindret av vanskeligheter med å produsere det rekombinante protein. Her er en pålitelig prosedyre for utarbeidelse av rekombinant Mgm101 beskrevet. Maltose Binding Protein (MBP)-merket Mgm101 er først uttrykt i Escherichia coli. Fusjonsproteinet blir først renset ved amylose affinitetskromatografi. Etter å ha blitt frigitt av proteolytiske spalting, er Mgm101 skilt fra MBP etter kationbytter kromatografi. Monodispersed Mgm101 blir deretter innhentetav størrelse utelukkelse kromatografi. Man fikk et utbytte på ~ 0,87 mg Mgm101 per liter bakteriekultur kan være rutinemessig oppnådd. Den rekombinant Mgm101 har minimal forurensning av DNA. De preparerte prøvene hell brukes til biokjemiske, strukturelle og enkelt partikkel Billedanalyseseksjonen av Mgm101. Denne protokollen kan også anvendes for fremstilling av andre store oligomere DNA-bindende proteiner som kan være toksiske for Misfolded og bakterieceller.
Introduction
Homolog rekombinasjon er viktig for reparasjon av dobbel-tråd pauser (DSBs) og interstrand crosslinks, og for reinitiation av DNA replikering fra sammenraste replikering gafler en. I konvensjonell homolog rekombinasjon, er det sentrale reaksjon katalysert av ATP-avhengige recombinases inkludert RECA i prokaryoter, og RAD51 og Dmc1 i eukaryoter 1-3. Disse recombinases danne nucleoprotein filamenter på ssDNA, som er avgjørende for å initiere homologi søk og strand invasjon innen duplex DNA maler (figur 1, venstre panel) 4-7. I tillegg til det konvensjonelle ordningen, kan homolog rekombinasjon også finne sted i en RecA/Rad51-independent måte (fig. 1, høyre panel). For eksempel kan de gjær Rad52 og Rad59 proteiner direkte katalysere avspenning av komplementære ssDNA tråder som er utsatt ved resectioning av dsDNA pauser. Denne rekombinasjon prosess, kjent som syngele strand avspenning, betyr som regel ikke medføre homologe sammenkobling med dsDNA maler. Etter gløding, er heterologe haler fjernet ved eksonukleaser og hakk ligeres for å gjenopprette genom kontinuitet 8-10. Reparasjon av enkelt strand avspenning mekanismen er ofte ledsaget av sletting av genomisk sekvenser mellom direkte gjentatte regioner.
Rad52 tilhører en mangfoldig gruppe av rekombinasjon proteiner som er utbredt blant bakteriofager 11. Disse proteinene er også kjent som enkelt streng Annealing proteiner (SSAPs), basert på deres aktivitet i å fremme annealing av homolog enkelttrådet DNA-molekyler. De beste kjennetegnet bakteriofag SSAPs er Redβ og Erf fra bakteriofager λ og P22, Rect fra prophage rac og Sak protein fra Lactococcus fag ul36. De SSAPs er strukturelt karakterisert ved en typisk β-β-β-α fold, selv om likheten undetect taltstand i sine primære sekvenser. De alle danner store homo-oligomeric ringer av 10-14 ganger symmetri in vitro 12-14. De funksjonelle implikasjoner av denne karakteristiske høyere orden strukturelt er ikke godt forstått.
Vi er interessert i å forstå mekanismen av homolog rekombinasjon i mitokondrielle genomet. Vi har tidligere identifisert MGM101 gen som er viktig for vedlikehold av mtDNA i Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 ble senere funnet å være assosiert med mitokondrie nucleoids og er nødvendig for toleranse av mtDNA til DNA-skadende agenter 16. Imidlertid har studien av Mgm101 blitt holdt tilbake i det siste tiåret av problemer med å produsere rekombinant Mgm101. Vi har nylig lykkes i å produsere løselig Mgm101 på store mengder fra E. coli ved hjelp av MBP-fusion strategi. Dette har gjort oss i stand til å demonstrere at Mgm101 aksjerbiokjemiske og strukturelle likheter med Rad52-familien av proteiner 17,18. I denne rapporten er en tre-trinns renseprosess som er beskrevet, som produserer homogene Mgm101for biokjemiske og strukturelle analyser (figur 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har vært en utfordring å få et stabilt, native rekombinant Mgm101 protein fra E. coli eventuelt på grunn av sin uoppløselighet i bakterieceller. I denne rapporten viser vi at MBP-fusion strategi gjør at proteinet skal bli uttrykt på et rimelig høyt nivå. Ved hjelp av negativ farging transmisjonselektronmikroskopi og gelfiltrerings-kromatografi, vi har tidligere vist at MBP-fusjonsproteinet danner ensartede oligomerer in vitro 18.. Det er mulig at folding og oligomerisering av Mg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Stephan Wilkens for hjelp i transmisjonselektronmikroskopi. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant R01AG023731.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
- Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
- Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
- Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
- Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
- Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
- Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Génétique. 153, 1117-1130 (1999).
- Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
- Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
- Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
- Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
- Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
- Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
- Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
- Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
- Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
- Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
- Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
- Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
- Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).
