Подготовка Mgm101 рекомбинации белка на основе МВР тегов стратегии
Summary
Митохондриальных белков дрожжей нуклеоидом, Mgm101, является Rad52 типа рекомбинации белок, который образует крупные олигомерные кольцами. Протокол описан подготовить растворимых рекомбинантных Mgm101 использованием белок, связывающий мальтозу (МВР)-тегов стратегия в сочетании с катионообменной хроматографии и гель.
Abstract
Ген MGM101 был определен 20 лет назад за его роль в поддержании митохондриальной ДНК. Исследования, проведенные в нескольких группах показали, что белок Mgm101 участвует в рекомбинационной репарации митохондриальной ДНК. Недавние исследования показали, что Mgm101 связана с Rad52 типа белка семейства рекомбинации. Эти белки образуют крупные олигомерные кольца и содействие отжига гомологичных одноцепочечной молекулы ДНК. Тем не менее, характеристика Mgm101 было затруднено из-за сложности в производстве рекомбинантного белка. Здесь надежный способ получения рекомбинантного Mgm101 описано. Белок, связывающий мальтозу (МВР) с метками Mgm101 впервые экспрессируется в E. coli. Слитый белок сначала очищали аффинной хроматографией амилозы. После освобождения путем протеолитического расщепления, Mgm101 отделена от MBP с помощью хроматографии катионного обмена. Монодисперсные Mgm101 затем получаютпо размеру хроматографии. Выход ~ 0,87 мг Mgm101 на литр бактериальной культуры может быть получена регулярно. Рекомбинантный Mgm101 имеет минимальное загрязнение ДНК. Подготовленные образцы успешно используются для биохимических, структурных и одна частица изображений анализы Mgm101. Этот протокол может также использоваться для получения других больших олигомерные ДНК-связывающих белков, которые могут быть неправильно свернутых и токсичными для бактериальных клеток.
Introduction
Гомологичной рекомбинации важных для ремонта разрывов двойной нити (ДР) и interstrand поперечные связи, а для повторной инициации репликации ДНК из-под разрушенных вилки репликации 1. В обычной гомологичной рекомбинации, центральный реакция катализируется АТФ-зависимый рекомбиназы включая RecA у прокариот и Rad51 и Dmc1 у эукариот 1-3. Эти рекомбиназ образуют нуклеопротеином нитей на одноцепочечной ДНК, которые необходимы для начала поиска гомологии и прядь вторжения в дуплекс ДНК-матриц (рис. 1, слева) 4-7. В дополнение к обычной схеме, гомологичной рекомбинации также может иметь место в RecA/Rad51-independent образом (рис. 1, справа). Например, дрожжи Rad52 и Rad59 белки могут непосредственно катализировать отжига комплементарных нитей оцДНК, которые подвергаются по резекции разрывов двухцепочечной ДНК. Этот процесс рекомбинации, известный как петьLe прядь отжига, как правило, не связаны с гомологичными сопряжения с шаблонами двухцепочечной ДНК. После отжига гетерологичных хвосты удаляются экзонуклеазами и ники лигируют к восстановлению 8-10 геном непрерывности. Ремонт по одной пряди механизмом отжига часто сопровождается делеции геномных последовательностей между непосредственно повторяется регионах.
Rad52 принадлежит разнообразная группа белков, которые рекомбинации широко распространены среди бактериофагов 11. Эти белки также известны как Одноместный Strand отжига Белки (SSAPs), основанный на их деятельности в продвижении отжига гомологичных одноцепочечной молекулы ДНК. Лучше всего характеризует SSAPs бактериофага Redβ и Erf от бактериофагов λ и Р22, прямоугольный от профаге RAC и белок от Сак lactococcal ul36 фага. SSAPs структурно характеризуется типичным β-β-β-α раза, хотя сходство практически undetectсостоянии в их первичных последовательностей. Все они образуют большие гомо-олигомерных кольца из 10 – 14 кратной симметрии в пробирке 12-14. Функциональное значение этой характеристики высшего порядка структурной организации не очень хорошо понял.
Мы заинтересованы в понимании механизма гомологичной рекомбинации митохондриального генома. Ранее мы уже определили MGM101 ген, который имеет важное значение для поддержания мтДНК в Saccharomyces CEREVISIAE 15. MGM101 Впоследствии было обнаружено, связаны с митохондриальной нуклеоидах и необходима для допуска мтДНК с ДНК-повреждающих агентов 16. Тем не менее, изучение Mgm101 был проведен еще в последнее десятилетие из-за сложности для получения рекомбинантного Mgm101. Мы недавно удалось получить растворимые Mgm101 в больших количествах из E. палочка помощью MBP-Fusion стратегии. Это позволило нам продемонстрировать, что Mgm101 акцийбиохимические и структурные сходства с Rad52-семейства белков, 17,18. В этом отчете, трехступенчатой очистки процедура описана, который производит однородную Mgm101for биохимических и структурного анализа (рис. 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Это был вызов для получения стабильного, родные рекомбинантного белка из Mgm101 E. кишечной возможно, из-за его нерастворимость в бактериальных клетках. В этом докладе, мы покажем, что MBP-Fusion стратегии позволяет белку быть выражены на достаточно высоком уровне. При использовании отриц?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Стефан Wilkens за помощью в просвечивающей электронной микроскопии. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант R01AG023731.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
- Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
- Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
- Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
- Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
- Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
- Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Génétique. 153, 1117-1130 (1999).
- Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
- Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
- Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
- Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
- Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
- Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
- Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
- Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
- Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
- Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
- Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
- Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
- Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).
