דגם איסכמיה reperfusion של פגיעה חריפה בכליות ופגיעים ההודעה פיברוזיס בעכברים
Summary
אנו מתארים מודלים של פגיעה בכליות הנגרמות איסכמיה reperfusion בינוניות וקשות שבו העכברים עוברים הידוק חד צדדי ואחרי כריתת כליה הנגדית בו זמנית או עיכוב, בהתאמה pedicle כליות. מודלים אלה נותנים באופן עקבי עלייה לפגיעה בתפקוד הכלייתי וסיסטיק לאחר פציעה, אך חומרת פציעה והישרדות תלויות ברקע, גיל וכירורגי ציוד עכבר.
Abstract
פגיעה בכליות איסכמיה reperfusion מושרה חריפות (IR-AKI) היא בשימוש נרחבת כמודל של AKI בעכברים, אך תוצאות הן לעתים קרובות משתנים מאוד עם שיעורי תמותה גבוהים, בדרך כלל לא מדווחים שעשויה לבלבל ניתוחים. clamping pedicle כליות דו צדדית משמשת בדרך כלל כדי לגרום IR-AKI, אבל הבדלים בין לחצים יעילים מהדק ו / או תגובות הכליה לאיסכמיה בין הכליות לעתים קרובות להוביל לתוצאות משתנות יותר. בנוסף, ידועות פעמים מהדק קצרות יותר כדי לגרום לפגיעה בצינורי משתנה יותר, ואילו עכברים שעברו פגיעה דו צדדית עם זמנים ארוכים יותר לפתח פציעת מהדק צינורי עקבית יותר, לעתים קרובות הם מתים בתוך 3 הימים הראשונים לאחר פגיעה עקב אי ספיקת כליות חמורה. כדי לשפר את ההישרדות לאחר פציעה ולהשיג תוצאות יותר עקביות וצפויות, פיתחנו שני מודלים של פציעת איסכמיה reperfusion חד צדדית ואחרי כריתת כליה הנגדית. שני הניתוחים מבוצעים באמצעות גישת גב, הפחתת לחץ כירורגית כתוצאה Flaparotomy הגחון ROM, משמש בדרך כלל לניתוחי IR-AKI עכבר. לאינדוקציה של BALB / ג פציעה בינוני לעבור חד צדדי ההידוק של גבעול כליה עבור 26 דקות וגם לעבור כריתת כליה הנגדית בו זמנית. שימוש בגישה זו, 50-60% מעכברים לפתח HR המתון AKI 24 לאחר פציעה אבל 90-100% מעכברים לשרוד. כדי לגרום לאקי חמור יותר, BALB / ג לעבור pedicle כליות הידוק למשך 30 דקות ואחרי כריתת כליה הנגדית 8 ימים לאחר פציעה. זה מאפשר הערכה תפקודית של התאוששות כליה לאחר פגיעה עם 90-100% הישרדות. נזק מוקדם לאחר פציעת צינורי כמו גם סיסטיק פגיעה פוסט עקבי ביותר משתמש במודל זה.
Introduction
מגוון רחב של דגמים ניסיוניים של ניזק כלייתי חריף (AKI) פותחו כדי להתאים את המגוון ומורכבות של המצב האנושי (ראה התייחסות לביקורת האחרונה, מקיפה 1). כל אחד מהמודלים הללו יש יתרונות וחסרונות משלה, ובעוד כל אחד מחקה את התנאים האנושיים המתאימים עם יעילות מגוונת, אף אחד בדיוק מודל הפתופיזיולוגיה של עמיתיהם האדם שלהם. reperfusion איסכמיה (IR) הנגרמים AKI פותחה כמודל של פגיעת כלייתית הנגרמת איסכמיה חריפה במכרסמים. בעוד חומרת פגיעת כלייתית צינורי לראות במודל זה היא ציין רק לעתים נדירות בחולים עם פציעות hypoperfusion כליות 2, על אף מגבלותיו ובעיקר בגלל האופי לשעתק יחסית של מודל זה, השימוש הנרחב שלה סיפקה, והוא צפוי, ימשיך כדי לספק תובנות חשובות לרבים מהמנגנונים המשותפים הבסיסיים של אקי, התיקון, וטיפול 3. IR ניתוח דורש familiarity עם האנטומיה כליות העכבר, מה שיש לנו שמודגמות בצורה פשוטה יותר באיור 1. (IR) ניתוח פציעת איסכמיה reperfusion כליות יכול להתבצע באמצעות הגחון (laparotomy) או הגבי (retroperitoneal) גישות. אנו משתמשים בגישה הגבי שכן הוא פחות טראומטי, ומאפשר החלמה מהירה יותר פעמים והישרדות משופרת (במיוחד כאשר לומדים את ההליך ראשון). פציעת IR כליות יכולה להתבצע באופן חד צדדי או דו צדדי. עם זאת, הבדלים בין לחצים יעילים מהדק (העשויים לנבוע מחציצה של שומן perihilar בין לסתות מהדק) ו / או הבדלים בתגובות בין הכליה לאיסכמיה צדדים מובילים לתוצאות משתנות יותר. אמנם זה לא בעיה בלתי עבירה, זה יכול להגדיל את השונות בין ניסויים, אשר היא בעיה רצינית עבור דגם זה. IR חד צדדי ניתן לבצע עם כריתת כלית קונטרה, לרוחב. זו השיטה שלנו לבחירה שכן הוא מפחית את השונות בהידוק בין pedicles, ובו בזמןllows אחד כדי להעריך את תפקוד כליות, שאינו מושפע עם IR חד צדדי בלבד. יש כבר דיון על מה היא השיטה המעשית לעומת אופטימלית ביותר להערכת תפקוד כליות בעכברים. חנקן אוריאה דם (BUN) מספק מדד לתפקוד כליות ומהווה סמן שימושי "מבט ראשון" בכמה דגמים של אקי, כולל פגיעת IR. עם זאת, יכולות להיות מושפעות ברמות BUN ידי מעמד נפח של העכברים אשר עשוי להיות מושפעים, במיוחד לאחר פציעת IR גישת הגחון, כאשר התאוששות מתעכבת מפחיתה את הצריכה אוראלית של נוזלים במשך מספר הימים לאחר ניתוח. קריאטינין בסרום מושפע פחות ממצב הידרציה אבל בבירור מושפע מסת שריר. אחד הקשיים עם מדידות קריאטינין בסרום היה בעיות עם זיהוי של chromogens הלא קריאטינין בסרום עכבר תוך שימוש בטכניקות המבוססות על חומצת picric. כחלופה, מספר המרכזים פיתחו שיטה מבוססת HPLC לכמת קריאטינין העכבר שאינו מושפע מ4 החפץ הזה. עם זאת, UNLאייק לחמנייה ומבחני קריאטינין חומצת picric, שרק דורשים μl 5-10 של סרום, HPLC-מבחני דורשים ~ סרום 25 μl לassay, שאם מתבצע בכפולות ידרשו ~ 100 μl של דם מלא לassay. זו יכולה להיות מגבילה עבור מחקרי עכבר. מרכזים מסוימים פיתחו שיטות HPLC והמוניות המבוסס על ספקטרומטריית רגישות יותר, המאפשרות ניתוח של כמויות קטנות יותר לדוגמה 5, 6. עם זאת, טכנולוגיות אלה אינן זמינות באופן נרחב. , Assay מפל האנזימטית חלופי (אשר דורש μl 5-10 רק של סרום) הוערך בעכבר ובדגימות סרום חולדות והראה במקביל מקרוב מדידות HPLC של קריאטינין בסרום בעוד שמבחני picric החומצה תמיד ערכי קריאטינין מעל אומדן 7. בעוד assay זה אינו בשימוש נרחב בספרות אקי, assay הוא זמין באופן מסחרי, פשוט לשימוש, ואנחנו מוצאים את נותן תוצאות אמינות עם המודל הזה של IR-Induced AKI בעכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים שני מודלים של IR-AKI כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת כלייתית בינונית וקשה. מודלים אלה מאפשרים לנו לגרום לפציעה עקבית וצפויה עם תמותה נמוכה. הפרוטוקול שלנו מתאר רבים מהקשיים והחסרונות הקשורים באופן מסורתי עם המודל הזה. יתר על כן, יש לנו הראינו כי בהתאם לאורכו של ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מעבדתו של ד"ר דה Caestecker נתמכת על ידי NIH 1RO1 HL093057-01 ו1RC4DK090770-01. המעבדה של ד"ר האריס נתמכת על ידי DK38226, DK51265, DK62794 ומימון ממנהל הוותיקים. תמיכה עבור ניתוחי עכבר כליות פציעה, קריאטינין בסרום, מבחני סיסטיק גם הניתנים על ידי או 'בריין ונדרבילט הכליה פגיעה מרכז מענק 1P30 DK079341.
Materials
| Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |
References
- Singh, A. P., Junemann, A., Muthuraman, A., Jaggi, A. S., Singh, N., Grover, K., Dhawan, R. Animal models of acute renal failure. Pharmacological reports: PR. 64, 31-44 (2012).
- Heyman, S. N., Rosenberger, C., Rosen, S. Experimental ischemia-reperfusion: Biases and myths-the proximal vs. Distal hypoxic tubular injury debate revisited. Kidney Int. 77, 9-16 (2010).
- Lieberthal, W., Nigam, S. K. Acute renal failure. II. Experimental models of acute renal failure: Imperfect but indispensable. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F1-F12 (2000).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65, 1959-1967 (2004).
- Yuen, P. S., Dunn, S. R., Miyaji, T., Yasuda, H., Sharma, K., Star, R. A. A simplified method for HPLC determination of creatinine in mouse serum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, F1116-F1119 (2004).
- Hetu, P. O., Gingras, M. E., Vinet, B. Development and validation of a rapid liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry (LC-IDMS/MS) method for serum creatinine. Clin. Biochem. 43, 1158-1162 (2010).
- Keppler, A., Gretz, N., Schmidt, R., Kloetzer, H. M., Groene, H. J., Lelongt, B., Meyer, M., Sadick, M., Pill, J. Plasma creatinine determination in mice and rats: An enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in G2/M mediates kidney fibrosis after injury. Nat. Med. 16, 535-543 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, 462-468 (1986).
- Chawla, L. S., Amdur, R. L., Amodeo, S., Kimmel, P. L., Palant, C. E. The severity of acute kidney injury predicts progression to chronic kidney disease. Kidney Int. 79, 1361-1369 (2012).
- Lo, L. J., Go, A. S., Chertow, G. M., McCulloch, C. E., Fan, D., Ordonez, J. D., Hsu, C. Y. Dialysis-requiring acute renal failure increases the risk of progressive chronic kidney disease. Kidney Int. 76, 893-899 (2009).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69, 1023-1025 (2000).
- Muller, V., Losonczy, G., Heemann, U., Vannay, A., Fekete, A., Reusz, G., Tulassay, T., Szabo, A. J. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: Possible role of endothelin. Kidney Int. 62, 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion injury of the mouse kidney. Methods Mol. Biol. 886, 363-379 (2012).
