Se describen modelos de lesión renal por isquemia-reperfusión inducida moderada y grave en la que los ratones se someten a pedículo renal unilateral de sujeción seguida de simultánea o en diferido nefrectomía contralateral, respectivamente. Estos modelos dan consistentemente lugar a la disfunción renal y la fibrosis después de la lesión, pero gravedad de la lesión y la supervivencia dependen de equipos de fondo, la edad y quirúrgicos ratón.
La isquemia-reperfusión lesión renal aguda inducida (IR-AKI) es ampliamente utilizado como un modelo de lesión renal aguda en ratones, pero los resultados son a menudo muy variables con altas tasas de mortalidad, a menudo no declarados que pueden confundir los análisis. Pedículo renal bilateral de sujeción se utiliza comúnmente para inducir IR-AKI, pero las diferencias entre las presiones dispositivo de parada y / o respuestas a isquemia renal entre los riñones a menudo conducen a resultados más variables. Además, se conocen tiempos más cortos de sujeción para inducir la lesión tubular más variable, y mientras que los ratones sometidos a lesión bilateral con tiempos de fijación más largos desarrollan lesión tubular más consistente, que a menudo muere en los primeros 3 días después de la lesión debido a la insuficiencia renal grave. Para mejorar la supervivencia después de la lesión y obtener resultados más consistentes y predecibles, se han desarrollado dos modelos de lesión por isquemia-reperfusión unilateral seguido de nefrectomía contralateral. Ambas cirugías se realizan usando un abordaje dorsal, reducir el estrés quirúrgico resultante from laparotomía ventral, comúnmente utilizado para ratón IR-AKI cirugías. Para la inducción de lesiones ratones BALB / c se someten a moderados unilateral de sujeción del pedículo renal por 26 min y también se someten a nefrectomía contralateral simultánea. El uso de este enfoque, el 50-60% de los ratones desarrollan moderada AKI 24 horas después del daño, pero 90-100% de los ratones sobreviven. Para inducir la más severa AKI, los ratones BALB / c se someten a pedículo renal de sujeción durante 30 min seguido de nefrectomía contralateral 8 días después de la lesión. Esto permite una evaluación funcional de la recuperación después de una lesión renal con 90 a 100% de supervivencia. Daño tubular después de la lesión temprana, así como la fibrosis después de la lesión son muy coherentes usando este modelo.
Una variedad de modelos experimentales de lesión renal aguda (LRA) se han desarrollado para que coincida con la diversidad y la complejidad de la condición humana (véase la referencia para una revisión reciente, amplio 1). Cada uno de estos modelos tiene sus propias fortalezas y debilidades, y aunque cada imita las condiciones humanas correspondientes a diversas eficiencias, ninguno modelar con precisión la fisiopatología de sus homólogos humanos. La isquemia reperfusión (IR) inducida por AKI se ha desarrollado como un modelo de lesión renal inducida por isquemia aguda en roedores. Si bien la gravedad de la lesión tubular renal visto en este modelo se observa raramente en pacientes con lesiones de hipoperfusión renal 2, a pesar de sus limitaciones y en gran parte debido a la naturaleza relativamente reproducible de este modelo, su extenso uso ha proporcionado y, se espera, continuará proporcionar pistas importantes sobre muchos de los mecanismos básicos comunes de AKI, reparación, y la terapia 3. Cirugía IR requiere familiarity con la anatomía del riñón del ratón, que hemos ilustrado en una forma simplificada en la Figura 1. Cirugía de lesión renal por isquemia-reperfusión (IR) se puede realizar a través de enfoques ventrales (laparotomía) o dorsal (retroperitoneal). Nosotros usamos un enfoque dorsal ya que es menos traumática, lo que permite tiempos de recuperación más rápido y una mejor supervivencia (particularmente cuando primero aprender el procedimiento). Renal lesión IR se puede realizar de manera unilateral o bilateral. Sin embargo, las diferencias entre las presiones eficaces abrazadera (que pueden resultar de la interposición de grasa perihiliar entre las mordazas de sujeción) y / o diferencias en las respuestas a la isquemia renal entre los lados conduce a resultados más variables. Si bien esto no es un problema insuperable, puede aumentar la variabilidad entre los experimentos, que es un problema importante para este modelo. IR unilateral se puede realizar con nefrectomía contralateral. Este es nuestro método de elección, ya que reduce la variabilidad en la sujeción entre pedículos, y al mismo tiempo unallows uno para evaluar la función renal, que se ve afectada con IR unilateral solo. Se ha debatido sobre lo que es el método más práctico vs óptima para evaluar la función renal en ratones. Nitrógeno de urea en sangre (BUN) proporciona una medida de la función renal y es un "primer vistazo" marcador útil en algunos modelos de AKI, incluyendo lesión IR. Sin embargo, los niveles de BUN pueden verse afectadas por el estado del volumen de los ratones que pueden verse afectados, en particular después de enfoque ventral de la lesión por IR, cuando la recuperación retardada reduce la ingesta oral de fluidos para un número de días después de la cirugía. La creatinina sérica está menos influenciada por el estado de hidratación, pero está claramente afectada por la masa muscular. Una de las dificultades con las mediciones de creatinina sérica ha habido problemas con la detección de cromógenos no-creatinina en suero de ratón utilizando técnicas basadas en ácido pícrico. Como una alternativa, una serie de centros han desarrollado un método basado en HPLC para cuantificar la creatinina ratón que no se ve afectada por este artefacto 4. Sin embargo, UNLIke BUN y de creatinina de ácido pícrico ensayos, que sólo requieren 5-10 l de suero, HPLC-ensayos requieren ~ 25 l de suero por ensayo, que si se realiza en duplicado requerirá ~ 100 l de sangre entera por ensayo. Esto puede ser limitante para los estudios del ratón. Algunos centros han desarrollado métodos de HPLC y espectrometría de masas basado más sensibles que permiten el análisis de los volúmenes de muestra más pequeños 5, 6. Sin embargo, estas tecnologías no están ampliamente disponibles. Una, ensayo de cascada enzimática alternativa (que requiere sólo el 5-10 l de suero) se ha evaluado en muestras de suero de ratón y de rata y se muestra en paralelo estrechamente HPLC mediciones de creatinina en suero, mientras que los ensayos de ácido pícrico siempre los valores de creatinina sobre-estimación 7. Mientras que este ensayo no se utiliza ampliamente en la literatura AKI, el ensayo está disponible comercialmente, fácil de usar, y nos encontramos da resultados fiables con este modelo de IR inducida por lesión renal aguda en ratones.
Se describen dos modelos de IR-AKI para estudiar los efectos de la lesión renal moderada y grave. Estos modelos nos permiten provocar daño consistente y predecible con baja mortalidad. El protocolo describe muchas de las dificultades y peligros asociados tradicionalmente con este modelo. Por otra parte, hemos demostrado que, dependiendo de la longitud del pedículo renal de sujeción, el modelo induce una gran parte reversible leve y moderada AKI, o más severa AKI con una recuperación incompleta y la fibrosis renal …
The authors have nothing to disclose.
El laboratorio del Dr. de Caestecker el apoyo de NIH 1RO1 HL093057-01 y 1RC4DK090770-01. Laboratorio del Dr. Harris es apoyado por DK38226, DK51265, DK62794 y la financiación de la Administración de Veteranos. Apoyo a cirugías renales ratón lesiones, creatinina sérica, y ensayos de fibrosis también proporcionadas por la Vanderbilt O'Brien Kidney Injury Center subvención 1P30 DK079341.
Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
Tape | Durapore | 1538-0 | |
1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |