La isquemia-reperfusión modelo de lesión renal aguda y post lesión fibrosis en ratones

Summary

Se describen modelos de lesión renal por isquemia-reperfusión inducida moderada y grave en la que los ratones se someten a pedículo renal unilateral de sujeción seguida de simultánea o en diferido nefrectomía contralateral, respectivamente. Estos modelos dan consistentemente lugar a la disfunción renal y la fibrosis después de la lesión, pero gravedad de la lesión y la supervivencia dependen de equipos de fondo, la edad y quirúrgicos ratón.

Abstract

La isquemia-reperfusión lesión renal aguda inducida (IR-AKI) es ampliamente utilizado como un modelo de lesión renal aguda en ratones, pero los resultados son a menudo muy variables con altas tasas de mortalidad, a menudo no declarados que pueden confundir los análisis. Pedículo renal bilateral de sujeción se utiliza comúnmente para inducir IR-AKI, pero las diferencias entre las presiones dispositivo de parada y / o respuestas a isquemia renal entre los riñones a menudo conducen a resultados más variables. Además, se conocen tiempos más cortos de sujeción para inducir la lesión tubular más variable, y mientras que los ratones sometidos a lesión bilateral con tiempos de fijación más largos desarrollan lesión tubular más consistente, que a menudo muere en los primeros 3 días después de la lesión debido a la insuficiencia renal grave. Para mejorar la supervivencia después de la lesión y obtener resultados más consistentes y predecibles, se han desarrollado dos modelos de lesión por isquemia-reperfusión unilateral seguido de nefrectomía contralateral. Ambas cirugías se realizan usando un abordaje dorsal, reducir el estrés quirúrgico resultante from laparotomía ventral, comúnmente utilizado para ratón IR-AKI cirugías. Para la inducción de lesiones ratones BALB / c se someten a moderados unilateral de sujeción del pedículo renal por 26 min y también se someten a nefrectomía contralateral simultánea. El uso de este enfoque, el 50-60% de los ratones desarrollan moderada AKI 24 horas después del daño, pero 90-100% de los ratones sobreviven. Para inducir la más severa AKI, los ratones BALB / c se someten a pedículo renal de sujeción durante 30 min seguido de nefrectomía contralateral 8 días después de la lesión. Esto permite una evaluación funcional de la recuperación después de una lesión renal con 90 a 100% de supervivencia. Daño tubular después de la lesión temprana, así como la fibrosis después de la lesión son muy coherentes usando este modelo.

Introduction

Una variedad de modelos experimentales de lesión renal aguda (LRA) se han desarrollado para que coincida con la diversidad y la complejidad de la condición humana (véase la referencia para una revisión reciente, amplio ^1). Cada uno de estos modelos tiene sus propias fortalezas y debilidades, y aunque cada imita las condiciones humanas correspondientes a diversas eficiencias, ninguno modelar con precisión la fisiopatología de sus homólogos humanos. La isquemia reperfusión (IR) inducida por AKI se ha desarrollado como un modelo de lesión renal inducida por isquemia aguda en roedores. Si bien la gravedad de la lesión tubular renal visto en este modelo se observa raramente en pacientes con lesiones de hipoperfusión renal ^2, a pesar de sus limitaciones y en gran parte debido a la naturaleza relativamente reproducible de este modelo, su extenso uso ha proporcionado y, se espera, continuará proporcionar pistas importantes sobre muchos de los mecanismos básicos comunes de AKI, reparación, y la terapia ^3. Cirugía IR requiere familiarity con la anatomía del riñón del ratón, que hemos ilustrado en una forma simplificada en la Figura 1. Cirugía de lesión renal por isquemia-reperfusión (IR) se puede realizar a través de enfoques ventrales (laparotomía) o dorsal (retroperitoneal). Nosotros usamos un enfoque dorsal ya que es menos traumática, lo que permite tiempos de recuperación más rápido y una mejor supervivencia (particularmente cuando primero aprender el procedimiento). Renal lesión IR se puede realizar de manera unilateral o bilateral. Sin embargo, las diferencias entre las presiones eficaces abrazadera (que pueden resultar de la interposición de grasa perihiliar entre las mordazas de sujeción) y / o diferencias en las respuestas a la isquemia renal entre los lados conduce a resultados más variables. Si bien esto no es un problema insuperable, puede aumentar la variabilidad entre los experimentos, que es un problema importante para este modelo. IR unilateral se puede realizar con nefrectomía contralateral. Este es nuestro método de elección, ya que reduce la variabilidad en la sujeción entre pedículos, y al mismo tiempo unallows uno para evaluar la función renal, que se ve afectada con IR unilateral solo. Se ha debatido sobre lo que es el método más práctico vs óptima para evaluar la función renal en ratones. Nitrógeno de urea en sangre (BUN) proporciona una medida de la función renal y es un "primer vistazo" marcador útil en algunos modelos de AKI, incluyendo lesión IR. Sin embargo, los niveles de BUN pueden verse afectadas por el estado del volumen de los ratones que pueden verse afectados, en particular después de enfoque ventral de la lesión por IR, cuando la recuperación retardada reduce la ingesta oral de fluidos para un número de días después de la cirugía. La creatinina sérica está menos influenciada por el estado de hidratación, pero está claramente afectada por la masa muscular. Una de las dificultades con las mediciones de creatinina sérica ha habido problemas con la detección de cromógenos no-creatinina en suero de ratón utilizando técnicas basadas en ácido pícrico. Como una alternativa, una serie de centros han desarrollado un método basado en HPLC para cuantificar la creatinina ratón que no se ve afectada por este artefacto ^4. Sin embargo, UNLIke BUN y de creatinina de ácido pícrico ensayos, que sólo requieren 5-10 l de suero, HPLC-ensayos requieren ~ 25 l de suero por ensayo, que si se realiza en duplicado requerirá ~ 100 l de sangre entera por ensayo. Esto puede ser limitante para los estudios del ratón. Algunos centros han desarrollado métodos de HPLC y espectrometría de masas basado más sensibles que permiten el análisis de los volúmenes de muestra más pequeños ^{5, 6.} Sin embargo, estas tecnologías no están ampliamente disponibles. Una, ensayo de cascada enzimática alternativa (que requiere sólo el 5-10 l de suero) se ha evaluado en muestras de suero de ratón y de rata y se muestra en paralelo estrechamente HPLC mediciones de creatinina en suero, mientras que los ensayos de ácido pícrico siempre los valores de creatinina sobre-estimación ^7. Mientras que este ensayo no se utiliza ampliamente en la literatura AKI, el ensayo está disponible comercialmente, fácil de usar, y nos encontramos da resultados fiables con este modelo de IR inducida por lesión renal aguda en ratones.

Protocol

Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Tenga en cuenta que si se está realizando múltiples cirugías en diferentes ratones, enjuague los instrumentos después de su uso y después esterilizar con un esterilizador de cuentas caliente. No es suficiente en remojo en etanol al 70%. Dale 0,5 ml de S / C de solución salina normal estéril inmediatamente antes de la cirugía y después de la operación para compensar la pérdida de fluido corporal durante la cirugía. Pesar los ratones. </li…

Representative Results

Moderado IR inducida AKI. IR unilateral con nefrectomía contralateral simultánea reduce sustancialmente la variabilidad en los resultados, pero con cortos tiempos necesarios para los ratones para sobrevivir este procedimiento de fijación, todavía encontró que sólo el 50-60% de los ratones desarrolló la esperada insuficiencia renal 24 horas después de la lesión (Figura 3A). En términos prácticos, esto crea dificultades para la evaluación de los datos a menos que los estudios …

Discussion

Se describen dos modelos de IR-AKI para estudiar los efectos de la lesión renal moderada y grave. Estos modelos nos permiten provocar daño consistente y predecible con baja mortalidad. El protocolo describe muchas de las dificultades y peligros asociados tradicionalmente con este modelo. Por otra parte, hemos demostrado que, dependiendo de la longitud del pedículo renal de sujeción, el modelo induce una gran parte reversible leve y moderada AKI, o más severa AKI con una recuperación incompleta y la fibrosis renal …

Materials

Drug or solution	Company	Catalogue number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
			Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15″ W x 24″ Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2” x 2” Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
			Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.