マウスにおける急性腎障害とポスト傷害線維の虚血再灌流モデル
Summary
私たちは、マウスが受けている中等度および重度の虚血再灌流誘発性腎傷害のモデルを記述する一方的な腎茎それぞれ、同時または遅延対側腎摘出続いクランプ。これらのモデルは、一貫して腎機能障害や損傷後の線維化を生じさせるが、傷害の重症度と生存率は、マウス、背景、年齢や手術用機器に依存している。
Abstract
虚血再灌流誘発される急性腎傷害（IR-AKI）が広く、マウスにおけるAKIのモデルとして使用されますが、結果は、多くの場合、分析を混乱させることが高く、頻繁に報告されていない死亡率が非常に可変であるされています。両側性腎茎クランプは、一般的にIR-AKIを誘導するために使用されますが、効果的なクランプ圧および/または腎臓の間で虚血性腎応答の違いは多くの場合、変数の結果につながるされています。また、短いクランプ時間がより変動細管障害を誘導することが知られており、より長いクランプ時間でバイラテラル損傷を受けたマウスは、より一貫した管状の損傷を開発するが、それらはしばしば重度の腎不全に起因する損傷後の最初の3日以内に死亡する。損傷後の生存率を改善し、より一貫した予測可能な結果を得るために、我々は、反対側の腎摘出術に続いて一方的な虚血再灌流障害の2つのモデルを開発した。両方の手術をfを得外科応力を低減する、背アプローチを使用して実行され一般的にマウスIR-AKIの手術に使用ロム腹開腹、。中程度の傷害をBALB / cマウスの誘導のために一方的には26分間腎茎のクランプ受け、また同時対腎摘出を受ける。このアプローチを使用して、マウスの50〜60％は、損傷後の適度なAKI 24時間を開発するが、マウスの90〜100％は生き残る。より厳しいAKIを誘導するために、BALB / cマウスは、8日後の傷害反対側の腎摘出術に続いて30分間クランプ腎椎弓根を受ける。これは、90〜100％の生存率と損傷後の腎回復の機能評価を可能にします。初期の損傷後尿細管障害と同様にポスト傷害線維症は、このモデルを使用して高度に一貫しています。
Introduction
急性腎臓損傷（AKI）の実験モデルの様々な（最近の、包括的なレビュー1リファレンスを参照してください）人間の条件の多様性と複雑さを一致させるために開発されている。これらの各モデルは、独自の長所と短所があり、それぞれが様々な効率化に対応する人間の条件を模倣しながら、どれも正確に彼らの人間の対応の病態をモデル化しません。虚血再灌流（IR）誘発AKIは、げっ歯類の急性虚血誘発性腎障害のモデルとして開発されました。このモデルで見られる尿細管傷害の重症度はほとんどその限界にもかかわらず、腎低灌流傷害患者2で観察されておらず、主な理由このモデルの比較的再現性質のため、その広範な使用が提供していると、それが期待されている間、継続します共通の基本AKIのメカニズム、修理、治療3の多くの重要な洞察を提供する。 IR手術は家族を必要とします我々は、 図1の簡略化した形で示されているマウスの腎臓の解剖とiliarity。腎臓の虚血再灌流（IR）傷害の手術を腹側（開腹）または背側（後腹膜）のアプローチを介して行うことができる。それは少ない外傷であるため、我々はより速い回復時間と生存率の改善を（最初の手順を学習する場合は特に）ができ、背のアプローチを使用しています。腎IR傷害は一方的にまたは両側行うことができます。しかし、効果的なクランプ圧（クランプ顎の間perihilar脂肪の介在に起因するもの）および/または側面間虚血、腎応答の違いの差がより変動結果につながる。これは克服できない問題ではありませんが、それはこのモデルのための主要な課題となっている実験では、間の変動性を高めることができます。片側IRは対側腎摘出術を行うことができる。これは、椎弓根間のクランプの変動を減少するための選択肢の私たちの方法であり、同時にllows片側IR独りで影響を受けません腎機能を評価するための1、。マウスでは腎機能を評価するための最も実用的な対最適な方法であるかについて議論がありました。血中尿素窒素（BUN）は、腎機能の尺度を提供し、IR傷害を含むAKIのいくつかのモデルにおいて有用 "一見"マーカーである。しかし、BUNレベルが回復の遅れが日手術後数の流体の経口摂取を減少させるときに、特に腹側アプローチIR損傷後の、影響を受ける可能性があるマウスの体積の状態によって影響を受けることができる。血清クレアチニンは少ない水和の状態に影響されますが、明らかに筋肉量に影響されます。血清クレアチニン測定の困難の一つは、ピクリン酸ベースの技術を使用して、マウス血清中の非クレアチニン色原体の検出に問題があった。代替として、中心の数は、このアーティファクト4によって影響されないマウスクレアチニンを定量化するHPLCに基づく方法を開発した。しかし、UNLIKE BUNと血清のみの5-10μLを必要とピクリン酸クレアチニンアッセイは、HPLC-アッセイは〜25μlのアッセイあたりの血清、重複で行った場合1アッセイあたり全血の〜100μlのが必要になります。を必要とするこれは、マウスの研究に限定することができる。いくつかのセンターでは、小さいサンプル量5、6の分析を可能にする、より高感度HPLCおよび質量分析ベースのメソッドを開発しました。しかし、これらの技術は広く利用可能ではありません。常にピクリン酸アッセイ間の代替、酵素カスケードアッセイ（血清のわずか5〜10μlのを必要とする）は、マウスおよびラットの血清サンプルで評価し、血清クレアチニンの密接並列HPLC測定することが示されているオーバー推定クレアチニン値7。このアッセイが広くAKI文献に使用されていないが、アッセイは使用するために、シンプルな市販されており、我々は、マウスのIR誘発性AKIのこのモデルでは信頼性の高い結果が得られます見つける。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、中等度および重度の腎障害の影響を研究するためのIR-AKIの2つのモデルを記述する。これらのモデルは、私たちは、低死亡率と一貫性のある予測可能な傷害を誘発することができます。我々のプロトコルでは、伝統的にこのモデルに関連付けられた困難や落とし穴の多くを概説します。さらに、腎茎クランプの長さに応じて、モデルが不完全回復と持続的な腎線維症で、主に可逆軽…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
博士デCAESTECKERの研究室では、NIH 1RO1 HL093057-01と1RC4DK090770-01でサポートされています。博士はハリスの研究室はDK38226、DK51265、DK62794および退役軍人からの資金によってサポートされています。またバンダービルトオブライエン腎傷害センター助成1P30 DK079341が提供するマウスの腎臓の傷害手術、血清クレアチニン、および線維アッセイのサポート。
Materials
| Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |
References
- Singh, A. P., Junemann, A., Muthuraman, A., Jaggi, A. S., Singh, N., Grover, K., Dhawan, R. Animal models of acute renal failure. Pharmacological reports: PR. 64, 31-44 (2012).
- Heyman, S. N., Rosenberger, C., Rosen, S. Experimental ischemia-reperfusion: Biases and myths-the proximal vs. Distal hypoxic tubular injury debate revisited. Kidney Int. 77, 9-16 (2010).
- Lieberthal, W., Nigam, S. K. Acute renal failure. II. Experimental models of acute renal failure: Imperfect but indispensable. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F1-F12 (2000).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65, 1959-1967 (2004).
- Yuen, P. S., Dunn, S. R., Miyaji, T., Yasuda, H., Sharma, K., Star, R. A. A simplified method for HPLC determination of creatinine in mouse serum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, F1116-F1119 (2004).
- Hetu, P. O., Gingras, M. E., Vinet, B. Development and validation of a rapid liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry (LC-IDMS/MS) method for serum creatinine. Clin. Biochem. 43, 1158-1162 (2010).
- Keppler, A., Gretz, N., Schmidt, R., Kloetzer, H. M., Groene, H. J., Lelongt, B., Meyer, M., Sadick, M., Pill, J. Plasma creatinine determination in mice and rats: An enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in G2/M mediates kidney fibrosis after injury. Nat. Med. 16, 535-543 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, 462-468 (1986).
- Chawla, L. S., Amdur, R. L., Amodeo, S., Kimmel, P. L., Palant, C. E. The severity of acute kidney injury predicts progression to chronic kidney disease. Kidney Int. 79, 1361-1369 (2012).
- Lo, L. J., Go, A. S., Chertow, G. M., McCulloch, C. E., Fan, D., Ordonez, J. D., Hsu, C. Y. Dialysis-requiring acute renal failure increases the risk of progressive chronic kidney disease. Kidney Int. 76, 893-899 (2009).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69, 1023-1025 (2000).
- Muller, V., Losonczy, G., Heemann, U., Vannay, A., Fekete, A., Reusz, G., Tulassay, T., Szabo, A. J. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: Possible role of endothelin. Kidney Int. 62, 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion injury of the mouse kidney. Methods Mol. Biol. 886, 363-379 (2012).
