Ischämie-Reperfusion-Modell des akuten Nierenschädigung und nach der Verletzung Fibrose bei Mäusen

Summary

Wir beschreiben Modelle der mittelschweren und schweren Ischämie-Reperfusion-induzierte Nierenschädigung, in denen die Mäuse unterziehen einseitige renale Stiel Klemm gefolgt durch gleichzeitige oder verzögerte kontralaterale Nephrektomie sind. Diese Modelle konsequent führen zu Nierenfunktionsstörungen und posttraumatische Fibrose, aber Verletzungsschwere und Überleben sind abhängig von Maus Hintergrund, Alter und chirurgischen Einrichtungen.

Abstract

Ischämie-Reperfusion akuten Nierenschädigung (AKI-IR) wird weithin als ein Modell der AKI in Mäusen verwendet, aber die Ergebnisse sind oft sehr variabel mit hohen, oft nicht gemeldet Sterblichkeit, die Analysen verwechseln kann. Bilaterale renale Stiel Klemmung wird häufig verwendet, um IR-AKI induzieren, aber die Unterschiede zwischen effektiver Klemme Drücke und / oder renalen Reaktionen auf Ischämie zwischen Nieren oft mehr variable Ergebnissen führen. Darüber hinaus werden kürzere Klemme mal bekannt, mehr variable tubuläre Schädigung induzieren, während Mäuse und unterziehen bilateralen Verletzungen mit längeren Klemme mal konsequenter tubuläre Schädigung entwickeln sie oft innerhalb der ersten 3 Tage nach der Verletzung wegen schwerer Niereninsuffizienz sterben. Um nach der Verletzung das Überleben zu verbessern und zu erhalten mehr konsistente und vorhersagbare Ergebnisse, haben wir zwei Modelle der einseitigen Ischämie-Reperfusion Verletzungen durch kontralaterale Nephrektomie gefolgt entwickelt. Beide Operationen werden durchgeführt unter Verwendung eines dorsalen Zugang, wodurch chirurgischen Stress durch from ventralen Laparotomie, die gemeinhin für Maus IR-AKI Operationen verwendet. Für die Induktion der mittleren Verletzungen BALB / c Mäusen zu unterziehen einseitiger Einspannung des renalen Stiel für 26 min unterzogen und gleichzeitig kontralaterale Nephrektomie. Mit diesem Ansatz entwickeln 50-60% der Mäuse moderate AKI 24 Stunden nach der Verletzung, aber 90-100% der Mäuse überleben. Um weitere schwere AKI induzieren, unterziehen BALB / c Mäusen Nieren Stiel Klemmung für 30 min durch kontralaterale Nephrektomie 8 Tagen nach Verletzungen gefolgt. Dies ermöglicht funktionelle Beurteilung der Nierenfunktion Genesung nach Verletzungen mit 90-100% Überleben. Frühe posttraumatische Tubulusschäden sowie nach der Verletzung Fibrose sind sehr konsistent mit diesem Modell.

Introduction

Eine Vielzahl von experimentellen Modellen der akuten Nierenschädigung (AKI) wurden entwickelt, um die Vielfalt und Komplexität des menschlichen Daseins (siehe Referenz für eine aktuelle, umfassende Überprüfung ¹⁾ entsprechen. Jedes dieser Modelle hat seine eigenen Stärken und Schwächen, und während jeder ahmt die entsprechenden menschlichen Bedingungen mit unterschiedlichen Wirkungsgraden, keine präzise Modellierung der Pathophysiologie von ihren menschlichen Pendants. Ischämie Reperfusion (IR)-induzierten AKI als Modell von akuter Ischämie-induzierter Nierenschädigung in Nagetieren entwickelt. Während die Schwere der Schädigung der Nierentubuli in diesem Modell zu sehen ist selten bei Patienten mit renaler Minderdurchblutung Verletzungen ² beobachtet, trotz ihrer Einschränkungen und vor allem wegen der relativ reproduzierbare Natur dieses Modells seines umfangreichen Einsatzes hat vorgesehen, und es wird erwartet, wird weiterhin wichtige Erkenntnisse über viele der gemeinsamen grundlegenden Mechanismen der AKI, Reparatur und Therapie ^{3 vorzusehen.} IR Chirurgie erfordert familiarity mit der Maus Niere Anatomie, die wir in einer vereinfachten Form in Abbildung 1 dargestellt sind. Renal Ischämie-Reperfusion (IR) Verletzungen Operation kann über ventralen (Bauchschnitt) oder dorsal (retroperitoneale) Ansätze durchgeführt werden. Wir verwenden eine dorsale Ansatz, da es weniger traumatisch ist, so dass eine schnellere Genesung und eine verbesserte Überlebensrate (insbesondere, wenn das Erlernen der ersten Prozedur). Renal IR Verletzung kann einseitig oder beidseitig erfolgen. Dies führt jedoch Unterschiede zwischen effektiver Klemme Druck (die von Zwischenschaltung perihiläre Fett zwischen den Spannbacken führen) und / oder Unterschiede in der renalen Ischämie zwischen Reaktionen auf Seiten mehr unterschiedliche Ergebnisse. Zwar ist dies kein unüberwindbares Problem, kann es Variabilität zwischen den Experimenten zu erhöhen, das ist ein großes Problem für dieses Modell. Einseitige IR mit contra-lateraler Nephrektomie durchgeführt werden. Dies ist unsere Methode der Wahl, da es reduziert Variabilität Klemmung zwischen Pedikel und gleichzeitig einllows man beurteilen Nierenfunktion, die unberührt mit einseitiger IR allein ist. Es wurde darüber diskutiert, was ist die praktischste vs optimale Methode, um die Nierenfunktion bei Mäusen zu beurteilen. Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) liefert ein Maß für die Nierenfunktion und ist ein nützlicher "ersten Blick" Marker in einigen Modellen von AKI, einschließlich IR Verletzungen. Allerdings kann BUN Ebenen Vol. Status der Mäuse, die betroffen sein könnten betroffen sein, insbesondere nach ventralen Zugang IR Verletzungen, wenn verzögerte Erholung reduziert orale Aufnahme von Flüssigkeiten für eine Anzahl von Tagen nach der Operation. Serum-Kreatinin wird weniger durch Flüssigkeitszufuhr Status beeinflusst, sondern ist eindeutig durch Muskelmasse beeinflusst. Eine der Schwierigkeiten, mit Serum-Kreatinin-Messungen hat Probleme mit dem Nachweis der Nicht-Kreatinin Chromogene in Maus-Serum mit Pikrinsäure Techniken. Alternativ haben einige Zentren eine HPLC-basiertes Verfahren zur Maus Kreatinin quantifizieren, die nicht von diesem Artefakt ⁴ betroffen ist entwickelt. Allerdings unlike BUN und Kreatinin-Pikrinsäure-Assays, die nur verlangen 5-10 ul Serum, erfordern HPLC-Assays ~ 25 ul Serum pro Test, die, wenn sie in doppelte durchgeführt wird ~ 100 ul Vollblut pro Assay benötigt. Dies kann Mäusestudien limitierend sein. Einige Zentren haben empfindlichere HPLC und Massenspektrometrie-basierte Methoden, die Analyse kleiner Probenvolumina ^{5, 6} ermöglichen entwickelt. Allerdings sind diese Techniken nicht allgemein verfügbar. Eine Alternative, enzymatische Kaskade Assay (was nur 5-10 ul Serum) wurde in Maus und Ratte Serumproben wurden ausgewertet und gezeigt, dass eng parallel HPLC-Messungen von Serum-Kreatinin während Pikrinsäure-Assays immer überschätzen Kreatinin-Werte ^7. Während dieser Test ist nicht weit verbreitet in der AKI Literatur verwendet wird, ist der Test im Handel erhältlich, einfach zu bedienen, und wir finden, gibt zuverlässige Ergebnisse mit diesem Modell von IR-induzierten AKI in Mäusen.

Protocol

Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Beachten Sie, dass, wenn man mehrere Operationen durchführen wird auf verschiedenen Mäusen, Spülen Sie die Instrumente nach Gebrauch und dann sterilisieren mit einem heißen Perle Sterilisator. Es ist nicht ausreichend, um in 70% Ethanol einweichen. Geben Sie 0,5 ml S / C sterile Kochsalzlösung prä-und postoperativ sofort für den Verlust von Körperflüssigkeit während der Operation zu kompensieren. Wiegen die Mäuse. Anesthetize Maus mit IP…

Representative Results

Moderate IR-induzierten AKI. Einseitige IR mit gleichzeitiger kontralaterale Nephrektomie deutlich reduziert Schwankungen bei den Ergebnissen, aber mit kürzeren Klammer mal notwendig, dass die Mäuse, um dieses Verfahren zu überleben, haben wir noch festgestellt, dass nur 50-60% der Mäuse die erwartete Niereninsuffizienz 24 Stunden entwickelt nach der Verletzung (Abbildung 3A). In der Praxis bedeutet dies schafft Schwierigkeiten der Auswertung von Daten, es sei denn die Studien Behan…

Discussion

Wir beschreiben zwei Modelle der IR-AKI, um die Auswirkungen von mittelschweren und schweren Nierenschädigung zu studieren. Diese ermöglichen uns die konsistente und vorhersagbare Verletzungen mit geringer Sterblichkeit zu induzieren. Unser Protokoll beschreibt viele der Schwierigkeiten und Fallstricke traditionell mit diesem Modell verbunden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass abhängig von der Länge der renalen Stiel Klemmung, das Modell eine weitgehend reversible milde und moderate AKI oder mehr schwere AKI i…

Materials

Drug or solution	Company	Catalogue number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
			Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15″ W x 24″ Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2” x 2” Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
			Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.