Metabola Märkning och Membrane Fraktione för jämförande proteomik analys av<em> Arabidopsis thaliana</em> Fjädring cellkulturer
Summary
Här beskriver vi en robust metod för fraktionering av växtplasmamembran in i tvättmedelsresistenta och detergent lösliga membran baserad på en blandning av omärkt och in vivo fullt 15 N märkta Arabidopsis thaliana cellkulturer. Förfarandet används för jämförande proteomik studier för att förstå signaleringsprocesser.
Abstract
Plasma membranmikrodomäner är funktioner som bygger på de fysikaliska egenskaperna hos lipid-och sterol miljö och har särskilda roller i signalprocesser. Extrahera sterol berikad membranmikrodomäner från växtceller för proteomic analys är en svår uppgift, huvudsakligen på grund av flera framställningssteg och källor för föroreningar från andra cellulära utrymmen. Plasmamembranet utgör endast ca 5-20% av alla membranen i en växtcell, och därmed isoleringen av högt renat plasmamembranfraktionen är utmanande. En ofta använd metod inbegriper vattenhaltiga två-fasuppdelning i polyetylenglykol och dextran, vilket ger plasmamembranblåsor med en renhet av 95% 1. Sterol-rik membranmikrodomäner inom plasmamembranet är olösliga vid behandling med kall nonjoniska detergenter vid alkaliskt pH. Detta diskmedel beständiga membranfraktionen kan separeras från bulkplasmamembranet genom ultracentrifugering i såsomucrose gradient 2. Därefter kan proteinerna extraheras från lågdensitets bandet hos sackarosgradient av metanol / kloroform-utfällning. Extraherade protein kommer då att trypsin smälta, avsaltat och slutligen analyseras med LC-MS/MS. Vår utvinning protokoll för sterol rika mikroområden är optimerad för att förbereda rena tvättmedel resistenta membranfraktioner från Arabidopsis thaliana cellkulturer.
Vi använder fullständig metabolisk märkning av Arabidopsis thaliana fjädring cellkulturer med K 15 NO 3 som enda kvävekälla för kvantitativa jämförande proteomik studier efter biologisk behandling av ränta 3. Genom att blanda lika förhållanden mellan märkta och omärkta cellkulturer för gemensam utvinning protein påverkan av beredningssteg på slut kvantitativt resultat hålls på ett minimum. Även materialförlust under extraktion kommer att påverka både kontroll-och behandlingsprover på samma sätt, end därför förhållandet mellan ljus och heave peptid kommer att förbli konstant. I den föreslagna metoden antingen märkt eller omärkt cellodling genomgår en biologisk behandling, medan den andra fungerar som kontroll 4.
Introduction
År 1972, Jonathan Singer och Garth Nicolson föreslog vätskan mosaikmodellen en struktur modell av cellmembran, som ersätter protein-lipid-protein sandwich modell som allmänt accepterades i början av 1960. Singer och Nicolson postulerade att det biologiska membranet kan anses vara en tvådimensionell vätska, där alla lipid-och proteinmolekyler diffunderar fritt och lätt 5. Efter den tid, strukturmodell av plasmamembranet och kunskap om membranets sammansättning blev ännu mer komplicerad. Speciellt inom plasmamembranet, kan observeras strukturer såsom proteinkomplex och lipid / sterol baserade strukturellt oordnade mikroområden. I konstgjorda modell membran 6,7, kan steroler och sfingolipider sidled segregera från andra lipid arter att bilda regioner med förändrade fysiska egenskaper. Denna segregering inom cellmembranet orsakas främst av de själv associera egenskaper mellan steroler och högt saturated kolvätekedjor av phopsho-och sfingolipider 8. Särskilt de styva sterol ringarna gynnar interaktioner med styvare och rakare mättade fettarter och dessa interaktioner tvinga grann kolvätekedjor i flera förlängda konformationer, ökar membrantjocklek och hårdhet.
En av de vanligaste observerade egenskaperna hos sterol anrikad membranmikrodomäner var deras olöslighet vid behandling med icke-joniska detergenter såsom Triton X-100 eller Brij 35. Dessa fraktioner tros vara identisk med membranmikrodomäner och kallades rengöringsmedel resistenta membran (DRM) baserat på deras biokemiska beredningsmetod 2. Användningen av nonjoniska tvättmedel under DRM utvinning fått en del kritik som den biokemiska DRM preparatet inte direkt motsvarar någon specifik membranutrymmet i den levande cellen 9. Särskilt tvättmedels till proteinhalt verkar avgörande i sådana preparat, enolika detergenter s, såväl som olika mängder tvättmedel kan ge olika sammansättning av tvättmedelsresistent membranfraktionen 10. Men det finns bevis för att vissa proteinvarianter specifikt förknippar med dessa cellulära sterol rika membrandomäner, och att dessa proteiner är väl anrikas i biokemiska preparat av tvättmedel resistent membranfraktioner 11. Kärnan av proteiner som finns i växt DRM fraktion, och för vilka det finns i DRM var sterol beroende, var särskilt GPI-förankrade proteiner, såsom fasciclin liknande arabinogalactan proteiner (FLA) och medlemmar i SKU proteinfamiljen. Även vissa signalproteiner, såsom receptorliknande kinaser eller fosfolipaser hittades 11. Dessa resultat överensstämmer med många proteomik studier på däggdjursmembranmikrodomäner 12,13. Även i växter det finns allt fler bevis för rollen av membranmikrodomäner i samband med stress 14 –16.
Protokollet som beskrivs här ger en robust metod för fraktionering av plasmamembranmikrodomäner och i synnerhet använder ett protein till tvättmedel koncentration som tillåter oss att skildra stress förändringar av sterol rika membranutrymmet 4,11,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet presenteras i detta dokument innehåller många steg och alla är avgörande för att få rena och representativa fraktionering av anläggningen plasmamembranet i tvättmedel resistenta membran och tvättmedel lösliga fraktioner. Därför är det viktigt att följa varje steg enligt anvisningarna.
Behandling av plasmamembranet fraktion med icke-jonisk detergent (steg 3.2) har den starkaste påverkan på kvaliteten på membranmikrodomän fraktionering. För att erhålla reproduce…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
References
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
- Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
- Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
- Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
- Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. , (2011).
- Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
- Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
- Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
- Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
- Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
- Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
- Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
- Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
- Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
- Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
- Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
- van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
- Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
- Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
- Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
- Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
- Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
- Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
- Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
- Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
- Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
- Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).
