Ici, nous décrivons une méthode robuste pour le fractionnement des membranes plasmiques de plantes en détergents solubles dans les membranes résistantes et de détergent à base d'un mélange de non marqué et in vivo entièrement 15 N étiquetés cultures de cellules d'Arabidopsis thaliana. La procédure est appliquée pour des études comparatives de la protéomique pour comprendre les processus de signalisation.
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Article de méthode
Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de
Dans cet article
Résumé
Résumé
Plasma microdomaines membranaires sont des caractéristiques basées sur les propriétés physiques de l'environnement des lipides et des stérols et ont des rôles particuliers dans les processus de signalisation. Extraction microdomaines enrichis en stérols à partir de cellules végétales pour l'analyse protéomique est une tâche difficile principalement en raison de multiples étapes de préparation et sources de contaminations d'autres compartiments cellulaires. La membrane plasmique constitue seulement environ 5 à 20% de l'ensemble des membranes dans une cellule végétale, et par conséquent, l'isolement de la fraction de membrane plasmatique hautement purifié est difficile. Une méthode fréquemment utilisée consiste partitionnement aqueuse à deux phases dans le polyéthylène glycol et le dextrane, qui produit des vésicules de membrane de plasma avec une pureté de 95% 1. Microdomaines membranaires riches en stérols au sein de la membrane plasmique sont insolubles lors d'un traitement avec des détergents non ioniques à froid à un pH alcalin. Cette fraction de membrane résistant aux détergents peut être séparée de la membrane plasmique en vrac par ultracentrifugation en tant quegradient ucrose 2. Par la suite, les protéines peuvent être extraites de la bande de basse densité du gradient de saccharose par un mélange méthanol / chloroforme précipitation. Protéine extraite est ensuite digéré la trypsine, dessalée et enfin analysé par LC-MS/MS. Notre protocole d'extraction de microdomaines riches en stérols est optimisée pour la préparation de fractions membranaires de nettoyage détergentes résistant à partir de cultures de cellules d'Arabidopsis thaliana.
Nous utilisons marquage métabolique complète des cultures de cellules en suspension d'Arabidopsis thaliana avec K 15 NO 3 en tant que seule source d'azote pour les études protéomiques comparatives quantitatives suivantes de traitement biologique d'intérêt 3. Par les rapports de mélange égaux de cultures de cellules marquées et non marquées pour l'extraction des protéines de l'influence conjointe d'étapes de préparation de résultat quantitatif finale est maintenue à un minimum. De plus la perte de matière lors de l'extraction affecte à la fois le contrôle et le traitement des échantillons de la même manière, und donc le rapport de la lumière et le pilonnement peptide restera constante. Dans la méthode proposée soit marqué ou non marqué culture de cellules est soumis à un traitement biologique, tandis que l'autre sert de contrôle 4.
Introduction
En 1972, Jonathan Singer et Garth Nicolson proposé le modèle de la mosaïque fluide un modèle de la structure des membranes cellulaires, en remplaçant le modèle sandwich protéine-lipide-protéine qui a été généralement acceptée dans les années 1960. Singer et Nicolson ont postulé que la membrane biologique peut être considérée comme un liquide à deux dimensions où toutes les molécules de lipides et de protéines diffusent librement et facilement 5. Depuis ce temps, le modèle de la structure de la membrane plasmique et la connaissance de la composition de la membrane devient encore plus complexe. En particulier, au sein de la membrane plasmique, tels que des s....
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Protocole
PROCÉDURE
Des réactifs et tampons couramment utilisés dans le protocole d'extraction:
- JPL milieu pour des cultures de cellules en suspension d'Arabidopsis thaliana
- 3 uM de H 3 BO 3
- 3uM MnSO 4 x H 2 O
- 1,1 uM de ZnSO 4 x 7 H 2 O
- 0,15 uM KJ
- 0,03 pM de Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O
- 3 nM CoCl 2 x 6 H 2 O
- 3 nM CuSO 4 x 5 H 2 O
- 0,9 mM de CaCl 2 x 2 H 2 O
- MM MgSO 4 x 7....
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Résultats
Avec le protocole présenté à l'aide de cultures de cellules d'Arabidopsis métaboliquement marquées, il est possible d'isoler des membranes plasmatiques à partir de tissus végétaux (étape 2, les figures 2 et 4), et un enrichissement en résistant aux détergents des fractions de membrane à l'intérieur de la membrane plasmique (étape 3, les figures 3 et 5). Par la suite, le protocole permet l'extraction de protéines à partir de ces détergents résistant fractions.......
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Discussion
Le protocole présenté dans ce document comporte de nombreuses étapes et chacun d'eux est crucial pour obtenir un fractionnement pur et représentatif de la membrane plasmique de la plante dans les membranes résistantes des détergents et des fractions solubles dans des détergents. Par conséquent, il est important de suivre chaque étape les instructions.
Le traitement de la fraction de membrane plasmatique avec un détergent non-ionique (étape 3.2) a la plus forte influence sur la qualité de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
L'auteur, Witold Szymanski, est un employé de l'Institut Max Planck de physiologie moléculaire des plantes. L'auteur, Waltraud Schulze est un employé de l'Université de Hohenheim, en Allemagne.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Les produits chimiques ont été commandés à Sigma-Aldrich, sauf indication contraire | |||
| Ammoniac (solution mère à 25 %) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 &mu ; m | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyéthylène glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsine | Promega | V5113 | |
| Cocktail d’inhibiteurs de protéase (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifugeuse | Beckman | ||
| Lecteur de plaques | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-chromatographe | liquide Thermo Scientific | ||
| Spectromètre de masse LTQ-Orbitrap | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Centrifugeuse Eppendorf | ||
| 5417R | Thermomixeur Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
Références
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K.
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Réimpressions et autorisations
