Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em> Arabidopsis thaliana</em> Culturas suspensión celular
Summary
Aquí se describe un método robusto para el fraccionamiento de las membranas de plasma de plantas en las membranas solubles resistentes y detergentes detergente a base de una mezcla de no marcado e in vivo completamente 15 N cultivos de células de Arabidopsis thaliana etiquetados. El procedimiento se aplica para los estudios proteómicos comparativos para entender los procesos de señalización.
Abstract
Microdominios de membrana de plasma son características basadas en las propiedades físicas del entorno de lípidos y esteroles y tienen funciones específicas en los procesos de señalización. La extracción de microdominios de membrana enriquecidos con esteroles a partir de células de plantas para el análisis proteómico es una tarea difícil debido principalmente a múltiples pasos de preparación y las fuentes de contaminación de otros compartimentos celulares. La membrana plasmática constituye sólo alrededor del 5-20% de todas las membranas en una célula de planta, y por lo tanto el aislamiento de la fracción de membrana de plasma altamente purificado es un reto. Un método utilizado con frecuencia implica acuosa de partición de dos fases en glicol de polietileno y dextrano, que produce vesículas de la membrana de plasma con una pureza de 95% 1. Microdominios de membrana rica en esteroles dentro de la membrana de plasma son insolubles tras el tratamiento con detergentes no iónicos en frío a pH alcalino. Esta fracción de membrana resistente al detergente se puede separar de la membrana plasmática a granel por ultracentrifugación en comogradiente ucrose 2. Posteriormente, las proteínas se pueden extraer de la banda de baja densidad de la gradiente de sacarosa mediante precipitación de metanol / cloroformo. Proteína extraída a continuación, se digirió tripsina, se desalaron y finalmente analizado por LC-MS/MS. Nuestro protocolo de extracción para microdominios rica en esteroles está optimizado para la preparación de fracciones de membrana limpias detergente resistentes de cultivos de células de Arabidopsis thaliana.
Utilizamos marcaje metabólico completo de los cultivos celulares suspensión de Arabidopsis thaliana con K 15 NO 3 como única fuente de nitrógeno para los estudios proteómicos comparativos cuantitativos después del tratamiento biológico de interés 3. Mediante la mezcla de iguales proporciones de cultivos de células marcadas y no marcadas para la extracción de proteínas conjunta la influencia de pasos de preparación sobre resultado cuantitativo final se mantiene a un mínimo. También la pérdida de material durante la extracción afectará tanto el control y las muestras de tratamiento de la misma manera, unad, por tanto, la relación entre la luz y el péptido tirón se mantendrá constante. En el método propuesto ya sea marcada o no marcada cultivo celular se somete a un tratamiento biológico, mientras que el otro sirve como control 4.
Introduction
En 1972, Jonathan Singer y Garth Nicolson propusieron el modelo de mosaico fluido un modelo de estructura de las membranas celulares, en sustitución del modelo de sándwich proteína-proteína-lípido que en general se aceptó a principios de 1960. Singer y Nicolson postularon que la membrana biológica puede ser considerado como un líquido de dos dimensiones, donde todas las moléculas de lípidos y de proteínas se difunden libremente y fácilmente 5. Desde ese momento, la estructura del modelo de la membrana plasmática y el conocimiento de la composición de la membrana se hizo aún más complejo. En particular, dentro de la membrana plasmática, se pueden observar estructuras tales como complejos de proteínas y lípidos basados / esterol microdominios estructuralmente desordenados. En membranas modelo artificiales 6,7, esteroles y esfingolípidos pueden separar lateralmente de otras especies de lípidos para formar regiones con características físicas alteradas. Esta segregación dentro de la membrana celular es causada principalmente por las propiedades de auto-asociación entre esteroles y altamente sacadenas de hidrocarburos turated de phopsho-y esfingolípidos 8. En particular, los anillos de esterol rígidos favorecen interacciones con más rígido y especies de lípidos más recta saturados y estas interacciones obligan a cadenas de hidrocarburos vecinos en más conformaciones extendidas, el aumento de grosor de la membrana y la dureza.
Una de las características comúnmente observados de esterol enriquecido microdominios de membrana era su insolubilidad tras el tratamiento con detergentes no iónicos Triton X-100 tales o Brij 35. Estas fracciones se cree que son idénticos a los microdominios de membrana y fueron llamados membranas resistentes a detergentes (DRM) en función de su método de preparación bioquímica 2. El uso de detergentes no iónicos durante la extracción DRM recibió algunas críticas como la preparación DRM bioquímica puede no corresponder directamente a cualquier compartimento de membrana específico dentro de la célula viva 9. Particularmente, el detergente a la proporción de proteína parece crucial en tales preparaciones, unas de diferentes detergentes, así como diferentes cantidades de detergente pueden producir diferente composición de la fracción de membrana resistente al detergente 10. Sin embargo, hay evidencia de que las especies de proteínas particulares se asocian específicamente con estos dominios de membrana rica en esteroles celulares, y que estas proteínas son bien enriquecidas en preparaciones bioquímicas de fracciones de membrana de detergente resistente 11. El núcleo de proteínas que se encuentra en la fracción de DRM de la planta, y para los cuales la presencia de DRMs era esterol dependiente, fueron particularmente proteínas ancladas a GPI, como las proteínas-fasciclin como arabinogalactano (FLAS) y miembros de la familia de proteínas SKU. También se encontraron algunas proteínas de señalización, tales como quinasas o fosfolipasas similares al receptor de 11. Estos resultados son consistentes con muchos estudios proteómicos en microdominios de membrana de mamíferos 12,13. También en las plantas cada vez hay más pruebas para el papel de microdominios de membrana en el contexto de la respuesta de estrés 14 –16.
El protocolo descrito aquí proporciona un método robusto para el fraccionamiento de microdominios de membrana de plasma y en particular utiliza una proteína a la concentración de detergente que nos permite representar las alteraciones inducidas por el estrés de el compartimiento de membrana rica en esteroles 4,11,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo se presenta en este documento contiene muchos pasos y todos ellos son cruciales para obtener el fraccionamiento pura y representante de la membrana plasmática de plantas resistentes a las membranas de detergente y fracciones solubles detergentes. Por lo tanto, es importante seguir cada paso como se indica.
El tratamiento de la fracción de membrana de plasma con detergente no iónico (paso 3.2) tiene la mayor influencia en la calidad de la membrana de microdominios de fracciona…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
References
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