Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ<em> Арабидопсис</em> Подвеска Клеточные культуры
Summary
Здесь мы опишем надежный метод для фракционирования плазмы мембран растений в моющих устойчивых и моющих растворимых мембран на основе смеси немеченый и в естественных условиях польностью 15 N меченых культур арабидопсис клеток. Процедура применяется для сравнительных протеомных исследований, чтобы понять процессы сигнализации.
Abstract
Плазменные мембранные микродомены особенности, основанные на физических свойствах липидного и стеринового среды и имеют определенные роли в сигнальных процессов. Извлечение стеринов обогащенных мембранные микродомены из растительных клеток для протеомного анализа является трудной задачей в основном за счет нескольких стадий получения и источники загрязнений от других клеточных отсеках. Плазматической мембраны составляет лишь около 5-20% всех мембран в растительной клетке, и, следовательно, выделение высоко очищенной плазмы мембранной фракции является сложной задачей. Часто используемый способ включает водный двухфазной разделение в полиэтиленгликоле и декстрана, который дает в плазме мембранных везикул с чистотой 95% 1. Стерол богатых мембранные микродомены пределах плазматической мембране нерастворимы при обработке холодных неионогенных моющих средств при щелочном рН. Это моющее средство устойчивостью мембранную фракцию можно отделить от основной массы плазматической мембране с помощью ультрацентрифугирования в качествеucrose градиент 2. Впоследствии белки могут быть извлечены из группы низкой плотности в градиенте сахарозы по метанол / хлороформ осадков. Экстрагированного белка будет затем переваривали трипсином, обессоленной и, наконец анализируют с помощью LC-MS/MS. Наш протокол экстракции стеролов богатых микродоменов оптимизирован для подготовки чистых моющих устойчивостью мембранных фракций из культур арабидопсис клеток.
Мы используем полный метаболический маркировки арабидопсис культур подвеска клеток с К 15 NO 3 в качестве единственного источника азота для количественных сравнительных протеомных исследований следующих биологической очистки интерес 3. При смешивании равных соотношения меченых и без таковой клеточных культур для совместного извлечения белка влияние подготовительных шагов по окончательному количественного результате сохраняется на минимальном уровне. Также потери материала при добыче повлияет как контроль и образцы лечения таким же образом,д, следовательно, соотношение света и вертикальной качки пептида будет оставаться постоянным. В предлагаемом способе либо меченными или немеченными культуры клеток подвергается биологической очистки, а другой служит в качестве контроля 4.
Introduction
В 1972 году Джонатан Сингер и Гарт Николсон предложил модельном флюиде Мозаика структурную модель клеточных мембран, заменяя белок-липидных-белка сэндвич модель, которая была общепринятой в начале 1960-х. Singer и Nicolson постулировано, что биологическая мембрана может рассматриваться как двумерной жидкости, где все липидные и белковые молекулы диффундируют свободно и легко 5. С этого времени, структура модель мембраны плазмы и знания состава мембраны стала еще более сложной. В частности, в плазматической мембране, структуры, такие как комплексы белков и липидов / стерола на основе структурно неупорядоченных микродоменов можно наблюдать. В искусственных модельных мембранах 6,7, стерины и сфинголипиды может боков отделить от других липидных видов формирование регионов с измененными физическими возможностями. Это разделение в клеточной мембране в основном вызвано само-связывая свойствах между стерины и высоко саturated углеводородных цепей phopsho-и сфинголипидов 8. В частности, жесткие стериновые кольца пользу взаимодействия с жестче и прямее насыщенных видов липидов и эти взаимодействия заставить соседние углеводородные цепи в более длительных конформации, увеличением толщины мембраны и твердость.
Один из обычно наблюдаемых особенностей стеролов обогащенный мембранных микродоменов был их нерастворимость при обработке неионных детергентов, таких Triton X-100 или Brij 35. Эти фракции считается идентичным с мембранными микродоменов и назывались моющие стойкие мембраны (DRM) на основе их биохимического способа получения 2. Использование неионогенных моющих средств во время извлечения DRM получил некоторую критику как биохимический подготовка DRM не может напрямую соответствуют какой-либо конкретной мембраны отсеке внутри живой клетки 9. В частности, моющее средство соотношение белка кажется важным в таких препаратов,сек различные моющие средства, а также различные количества моющего средства может дать различный состав моющего средства устойчивы мембранной фракции 10. Тем не менее, существуют доказательства, что отдельные виды белковых конкретно связать с этими клеточными стеролов богатых мембранных доменов, и что эти белки хорошо обогащенный биохимических препаратов моющих устойчивостью мембранных фракций 11. Ядро белков, которые были найдены в растительной DRM фракции, и для которых присутствие в МБК зависит стериновый, были особенно GPI-якорь белки, такие как fasciclin-как арабиногалактановых белков (FLAS) и членов семейства белков SKU. Кроме того, некоторые сигнальные белки, такие как рецептор-подобных киназ или фосфолипаз были найдены 11. Эти результаты согласуются со многими протеомных исследований по млекопитающих мембранных микродоменов 12,13. Также в растениях появляется все больше доказательств на роль мембранных микродоменов в контексте ответа на стресс 14 –16.
Протокол, описанный здесь обеспечивает надежный метод для фракционирования плазмы мембранных микродоменов и, в частности использует белок для концентрации моющего средства, что позволяет нам изображать стресс, вызванный изменениями стерина богатых мембраны отсеке 4,11,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленные в этой статье, содержит много шагов, и все они имеют решающее значение для получения чистого и представительного фракционирование плазмы мембраны растений в моющих устойчивых оболочек и моющих растворимых фракций. Поэтому важно следить за каждым шагом в соот?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
References
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
- Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
- Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
- Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
- Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. , (2011).
- Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
- Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
- Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
- Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
- Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
- Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
- Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
- Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
- Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
- Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
- Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
- van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
- Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
- Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
- Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
- Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
- Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
- Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
- Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
- Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
- Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
- Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).
