Calciumphosphat Transfektion af primær hippocampusneuroner
Summary
Calciumphosphatpræcipitation er en praktisk og økonomisk fremgangsmåde til transfektion af dyrkede celler. Med optimering, er det muligt at anvende denne metode på svære at transficere celler som primære neuroner. Her beskriver vi vores detaljerede protokol for caiciumphosphattransfektion af hippocampus neuroner dyrket sammen med astrogliale celler.
Abstract
Calciumphosphatpræcipitation er en praktisk og økonomisk fremgangsmåde til transfektion af dyrkede celler. Med optimering, er det muligt at anvende denne metode på svære at transficere celler som primære neuroner. Her beskriver vi vores detaljerede protokol for caiciumphosphattransfektion af hippocampus neuroner dyrket sammen med astrogliale celler.
Introduction
Primære neuroner er en af de sværeste celletyper til transfektion, som de er postmitotiske og er meget følsomme over for mikro-miljø ændringer. Der er fire almindeligt anvendte typer af fremgangsmåder til ekspression af eksogene gener og short hairpin RNA (shRNAs) i disse celler 1. Hver har sine egne fordele og ulemper. For eksempel er elektroporering normalt udføres på frisk isolerede neuroner 2, som celler skal overføres til kuvetter til transfektion. Virus infektion kan normalt opnå en meget høj effektivitet 3, men er mere arbejdskrævende og risikabelt for operatører. Mange lipidmedieret transfektionsreagenser er kommercielt tilgængelige, med varierende grader af succes i neuroner og forskellige niveauer af cytotoksicitet.
Calciumphosphat-transfektion udgør en praktisk og økonomisk fremgangsmåde til indføring af fremmede gener i neuroner. Fremgangsmåden blev først anvendt til at indføre adenovirus DNA i mammale cells af Graham og Van Der Eb (1973) 4.. Transfektion blev udført ved at blande calciumchlorid med rekombinant DNA i en phosphatpuffer. Dette tillader dannelsen af DNA / calciumphosphatudfældninger som, når efterhånden faldt på et monolag af celler, holde sig til celleoverfladen, bliver taget op ved endocytose og endelig indtaste kernen 5.. Denne proces vil føre til ekspression af indførte fremmede gener i målcellen. Typiske effektiviteten af calciumphosphat-transfektion på mellem 0,5-5% 6-8. Men med omhyggelig optimering og konsekvent gennemførelse af forsøgsprotokollen, er det muligt at opnå en transfektionseffektivitet på næsten 50%. Her beskriver vi vores detaljerede protokol for caiciumphosphattransfektion af primære hippocampus neuroner, der er dyrket sammen med astrogliale celler i en sandwich-format 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere vigtige parametre, der skal kontrolleres omhyggeligt for konsekvent succesfulde transfektioner 10,11. Den mest kritiske parameter for calciumphosphat-transfektion er pH-værdien af 2x HBS, som i vore hænder normalt varierer mellem 7,10-7,15. Vi anbefaler at tre partier af aktier med pH-værdier på 0,05 intervaller at tage højde for forskellen mellem pH meter. Alternativt Ciontech pattedyr transfektion kit giver 2x HBS, der konsekvent giver god effektivitet. Husk på, at pH-værdien i opl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af NIH tilskud NS065183 og startfonde fra Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
