原代海马神经元的磷酸钙转染
Summary
磷酸钙沉淀是用于培养细胞的转染的便利和经济的方法。以优化，因此能够对难以转染细胞如原代神经元使用此方法。在这里，我们描述了我们详细的协议进行共培养与星形胶质细胞海马神经元的磷酸钙转染。
Abstract
磷酸钙沉淀是用于培养细胞的转染的便利和经济的方法。以优化，因此能够对难以转染细胞如原代神经元使用此方法。在这里，我们描述了我们详细的协议进行共培养与星形胶质细胞海马神经元的磷酸钙转染。
Introduction
原代神经元是最难的细胞类型，转染，因为它们是有丝分裂后，并以微环境的变化非常敏感的一个。有四种常用的类型的，在这些单元电池1的外源基因和短发夹RNA（的shRNA）的表达的方法。每个人都有自己的优点和缺点。例如，电穿孔，通常在新鲜分离的神经元2执行的，作为细胞必须被转移到比色杯中进行转染。病毒感染通常可以达到非常高的效率3，但更多的劳动力密集型和高风险的运营商。许多脂质介导的转染试剂是市售的，具有不同程度的神经元和不同程度的细胞毒性的成功。
磷酸钙转染代表了外源基因引入神经元既方便又经济的方法。该方法首先被用于引入腺病毒DNA导入哺乳动物CELLS由Graham和van der EB（1973）4。转染通过混合氯化钙与磷酸盐缓冲液的重组DNA进行。这使得DNA /磷酸钙形成沉淀，当逐渐下降到细胞单层，坚持到细胞表面，均是由内吞作用，最后进入细胞核5。这个过程将导致在靶细胞引入外源基因的表达。之间的0.5-5％6-8磷酸钙转染范围典型效率。然而，通过仔细的优化和实验方案的一致的执行，因此能够达到几乎50％的转染效率。在这里，我们描述了我们详细的协议，用于原代海马神经元，这是在一个三明治格式9共培养与星形胶质细胞的磷酸钙转染。
Protocol
Representative Results
Discussion
有迹象表明，需要仔细控制的一贯成功转染10,11几个关键参数。对于磷酸钙转染的最关键的参数是2×HBS，这在我们手中，通常7.10-7.15之间变化的pH值。我们建议将三批股票随pH值在0.05增量占pH计之间的差异。或者，Clontech公司哺乳动物转染试剂盒提供2倍哈佛商学院，始终产生良好的效益。记住，将溶液的pH值将甚至当在冰箱中存放随时间而改变。我们一般保持2倍哈佛商学院的分装于4℃下长?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS065183和启动从罗格斯大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院的资金支持。
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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