Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа
Summary
Фосфат кальция осадков удобный и экономичный способ для трансфекции культивируемых клеток. С оптимизации, можно использовать этот метод на труднодоступных трансфекции клеток, как первичных нейронов. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции нейронов гиппокампа совместно культивировали с астроглиальных клеток.
Abstract
Фосфат кальция осадков удобный и экономичный способ для трансфекции культивируемых клеток. При оптимизации, можно использовать этот метод на труднодоступных трансфекции клеток, как первичных нейронов. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции нейронов гиппокампа совместно культивировали с астроглиальных клеток.
Introduction
Первичные нейроны являются одним из самых сложных типов клеток для трансфекции, как они постмитотическими и очень чувствительны к микро-экологических изменений. Есть четыре наиболее часто используемые типы из методов экспрессии экзогенных генов и короткого шпильки РНК (shRNAs) в этих клетках 1. Каждый имеет свои преимущества и недостатки. Например, электропорацию обычно выполняется на свежеизолированных нейронов 2, как клетки должны быть переданы в кюветы для трансфекции. Вирус инфекция, как правило, добиться очень высокой эффективности 3, но более трудоемким и рискованным для операторов. Многие липидов-опосредованной трансфекции реагенты коммерчески доступны, с разной степенью успеха в нейронах и на разных уровнях цитотоксичности.
Фосфат кальция трансфекции представляет собой удобный и экономичный способ введения чужеродных генов в нейронах. Этот метод был впервые использован ввести аденовируса ДНК в чел млекопитающихлс по Грэм и Ван Дер Eb (1973) 4. Трансфекцию проводили путем смешивания хлорида кальция с рекомбинантной ДНК в фосфатном буфере. Это позволяет формирование фосфат ДНК / кальция выпадает в осадок, который при постепенно падает на монослой клеток, прилипают к поверхности клетки, принимаются к эндоцитоза и, наконец, проникает в ядро 5. Этот процесс приведет к экспрессии чужеродных генов, введенных в клетки-мишени. Типичные КПД фосфата кальция диапазоне трансфекции между 0,5-5% 6-8. Тем не менее, с тщательной оптимизации и последовательного выполнения экспериментального протокола, можно достичь эффективности трансфекции почти на 50%. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции первичных нейронов гиппокампа, которые совместно культивировали с астроглиальных клеток в сэндвич формате 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько ключевых параметров, которые должны быть тщательно контролируется для последовательно успешных трансфекций 10,11. Наиболее важным параметром для фосфата кальция трансфекции является значение рН 2х HBS, которые в наших руках, как правило, колеблется в пределах 7,10-7,15. М…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается NIH грант NS065183 и пуско-наладочных средств из Rutgers Роберта Вуда Джонсона медицинской школы.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
