Summary

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Published: November 12, 2013
doi:

Summary

Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.

Abstract

Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.

Introduction

Primaire neuronen zijn een van de moeilijkste celtypen te transfecteren ze postmitotic en zijn zeer gevoelig voor micro-omgevingsveranderingen. Er zijn vier courante methoden voor expressie van exogene genen en korte haarspeld RNA (shRNAs) in deze cellen 1. Elk heeft zijn eigen voor-en nadelen. Zo wordt elektroporatie meestal uitgevoerd op vers geïsoleerde neuronen 2, zoals cellen in cuvetten voor transfectie moet worden overgedragen. Virusinfectie kan bereiken doorgaans zeer hoog rendement 3, maar is meer arbeidsintensief en riskant voor de exploitanten. Veel lipide gemedieerde transfectie reagentia zijn commercieel verkrijgbaar, met wisselend succes in neuronen en verschillende niveaus van cytotoxiciteit.

Calciumfosfaattransfectie is een gemakkelijke en economische methode voor het introduceren van vreemde genen in neuronen. De werkwijze werd eerst gebruikt om adenovirus DNA in zoogdierlijke cells door Graham en Van der Eb (1973) 4. Transfectie werd uitgevoerd door mengen van calciumchloride met recombinant DNA in een fosfaatbuffer. Dit maakt de vorming van DNA / calciumfosfaat precipitaten die bij geleidelijk vallen op een monolaag van cellen hechten aan het celoppervlak worden door endocytose taken en voert uiteindelijk de kern 5. Dit proces leidt tot de expressie van geïntroduceerde vreemde genen in de doelcel. Typische rendementen van calciumfosfaattransfectie bereik tussen 0,5-5% 6-8. Echter, met een zorgvuldige optimalisatie en consistente uitvoering van het experimentele protocol, is het mogelijk om een ​​transfectie-efficiëntie van bijna 50% bereikt. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaat transfectie van primaire hippocampale neuronen, die worden gekweekt samen met astrogliale cellen in een sandwich formaat 9.

Protocol

1. Voorbereiden van Rat Astrocyte Cultuur voor geconditioneerde media en Astrocyte-neuron Coculturen. Bereid dissectie buffer (BSS, zie tabel 1 voor recept) en bewaar bij 4 ° C tot klaar voor gebruik. Verdoven neonatale rat pups (P0-P2) met isofluraan in een bekerglas van 500 ml. Wanneer pups zijn immobiel, spray met 70% ethanol en onthoofden. Verwijder de hersenen. Houd het hoofd vast met een paar Dumont # 5 tang, en gebruik fijne schaar om een ​​m…

Representative Results

Wanneer de verschillende parameters van de transfectie worden geoptimaliseerd en zorgvuldig gecontroleerd van experiment tot experiment, is het mogelijk transfectie efficiënties van tot 50% te verkrijgen. Figuur 1 toont een gebied van neuronen die zijn getransfecteerd met GFP op DIV4. Het veld bevat een totaal van 28 neuronen, waaronder 16 werden getransfecteerd. Dit vertegenwoordigt een rendement van meer dan 50%. Een steekproef van andere velden op dezelfde dekglaasje toont een totaal rendement van o…

Discussion

Er zijn een aantal belangrijke parameters die moeten zorgvuldig worden gecontroleerd voor consistent succesvol transfecties 10,11. De meest kritische parameter voor calciumfosfaat transfectie is de pH van 2x HBS, die in onze handen varieert meestal tussen 7,10-7,15. Wij raden het maken van drie partijen van de voorraden met pH-waarden in stappen van 0,05 om rekening te houden met het verschil tussen de pH-meter. Als alternatief, de Clontech zoogdieren transfectiekit biedt 2x HBS die consequent levert goede ef…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidie ​​NS065183 en start-up fondsen van de Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.

Materials

Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-20
Fine scissors Fine Science Tools 14090-09 straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors Fine Science Tools 15008-08 angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-16
Student surgical scissors Fine Science Tools 91401-14 blunt / 14.5 cm
Spring scissors Fine Science Tools 15006-09 angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane Webster Veterinary 14043-225-06
Poly-L-lysine Sigma P2636
MEM Sigma M2279
100 mM Sodium pyruvate Sigma S8636
Glucose Sigma G8270
10x HBSS Sigma H4385
1 M HEPES, pH 7.3 Gibco/Invitrogen 15630-080
GlutaMAX Gibco/Invitrogen 35050-061
Neurobasal Media Gibco/Invitrogen 21130-049
B27 Supplement (50x) Gibco/Invitrogen 17504-044
N2 Supplement Gibco/Invitrogen 17502-048
Ovalbumin Sigma A5503
Penicillin/Streptomycin Gibco/Invitrogen 15070-063
2.5% Trypsin Gibco/Invitrogen 15090-046
DNase I Sigma DN-25
Cytosine arabinoside Calbiochem/EMD Millipore 251010
Kynurenic acid Sigma K3375

References

  1. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  2. Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
  3. Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
  4. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  5. Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
  6. Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
  7. Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
  8. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
  9. Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
  10. Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
  11. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  12. Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).

Play Video

Cite This Article
Sun, M., Bernard, L. P., DiBona, V. L., Wu, Q., Zhang, H. Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (81), e50808, doi:10.3791/50808 (2013).

View Video