Summary
レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。
Abstract
両方の遺伝子発現の時間的および空間的調節は細胞機能に重要な影響を持つことができ、成長の実現は、単一の生細胞内の個別のRNA転写産物を視覚化するために多様な技術が開発された。最近記載されている一つの有望な技術は、3 '非翻訳領域におけるRBMB標的配列の少なくとも4つのタンデムリピートを含むように操作されたRNA転写産物を検出するためのオリゴヌクレオチドベースの光プローブ、レシオメトリック二分子ビーコン（RBMB）を利用する。 RBMBsを具体的に相補的なRNAへのハイブリダイゼーションの際に、明るい蛍光シグナルを発するように設計されているが、それ以外は急冷されたままになります。この方法で合成プローブの使用は、赤方偏移し、光安定性を可能にし、高度に発光性有機染料は、画像形成に使用される。広視野蛍光顕微鏡下で見たときの離散蛍光スポットにおける工学的RNA転写産物の結果を複数のRBMBsの結合。したがって、個別のRNA転写物の移動が容易に蛍光画像の時系列を取ることによって、リアルタイムで可視化することができる。ここでは、マイクロポと単一のRNA転写物の生細胞イメージングによる細胞への送達、RBMBsの調製および精製を記載している。
Introduction
RNA転写物の発現および調節は、細胞の挙動と運命を制御するための主な原因であり、複雑で動的なプロセスである。細胞機能を口述におけるRNAの重要性は以前から知られているが、ほとんどのRNAの解析ツールは、このような転写破裂、RNAなどの重要な調節事象を捕捉するために必要な空間および時間分解能を欠いているので、両者の間に明確な接続を描画することはしばしば困難である人身売買、およびローカライズされたRNAプロセシング。これは、個別のRNA転写物がリアルタイム1に生細胞内で可視化することを可能にするいくつかの技術の出現につながっている。おそらく、これらの技術の最も顕著な3'-UTR 2,3にMS2結合部位の縦列反復を含むように操作されたRNAを標的とGFP-MS2融合タンパク質を利用する。近接さ、複数のGFP分子をもたらすことで、個別のRNA転写物は、明るい蛍光スポットとして表示され蛍光顕微鏡を経由。 GFP-MS2システムは、直接可視化および転写の測定値4,5破裂 、ユニークな細胞内局在および処理6-9の検出、およびRNA輸送10のリアルタイムイメージングを含む、RNAの挙動に前例のない洞察を、提供してきました。しかし、GFP-MS2システムの大きな可能性にもかかわらず、結合していないGFP-MS2融合タンパク質は汎用性とこの技術のダイナミックレンジを制限する高いバックグラウンド蛍光信号を生成することができる。いくつかのアプローチは、タンパク質断片相補11、及び代替RNA結合タンパク質と12を標的に結合していないGFP-MS2 10の細胞内区画化を含む、このバックグラウンド信号を制限するために開発されてきた。しかしながら、これらのアプローチの全ては、RNA標的とGFP-MS2融合タンパク質の相対的な総発現に対して感受性のままである。
AとしてGFP-MS2システムにlternative、分子ビーコンはまた、3'-UTR 13,14における相補的な結合部位の縦列反復して操作されたRNA転写物を検出するために使用されてきた。分子ビーコンは、クエンチャーで、蛍光レポーターと他方の端部に一端で標識されているヘアピン形成オリゴヌクレオチドプローブである。標的RNAに結合されていない場合には蛍光レポーターとクエンチャーは、低蛍光状態になり、すぐ近くに残っています。ハイブリダイゼーションの際、蛍光レポーターとクエンチャーが離れて強制されると蛍光が復元されます。 GFP-MS2システムと同様、蛍光顕微鏡によって同定することができる明るい蛍光スポットにおける単一のRNA転写産物をもたらす上に複数の分子ビーコンの結合;しかしながら、バックグラウンド蛍光は、未結合の分子ビーコンの急冷構成に起因はるかに低いことが期待される。残念なことに、m個に組み込まれる巧妙な活性化メカニズムにもかかわらずolecularビーコンデザイン、生きている細胞に導入された場合にハイブリダイズしていない分子ビーコンは、ヘアピンコンフォメーションに残っていないことを成長している証拠がある。したがって、それらは有意にシグナル対バックグラウンドを低減する偽陽性シグナルを生成する。 15,16;この欠点を克服するために、私たちは最近、生きている細胞、レシオメトリック二分子ビーコン（ 図1A RBMBs）で画像化RNAのための新しい合成プローブを開発しました。 RBMBsは、短いヘアピンRNA（shRNA）、および分子ビーコンの両方から特徴を有するハイブリッド構造を形成する2つの2'-O-メチルオリゴヌクレオチド鎖から構成されている。 3'-UUオーバーハングの長い二本鎖ドメインはshRNAのより特徴的である間ループし、蛍光活性化機構は、分子ビーコンに似ています。 shRNAの機能は、核輸出を駆動するように設計されている私たちは> 24時間に増加した細胞内寿命を見つけている、最小限の観察劣化し、ループの非特異的な開口を防止する。結果RBMBsは、分子ビーコンよりも有意に高いシグナル対バックグラウンドを示した。
これは、DNAベースのプローブは、RNAベースのプローブと同じ核外輸送機能を有していないのでRBMBsは、DNAオリゴヌクレオチドを用いて調製することができないことに留意すべきである。構造的に、RBMBループは、典型的には、RNAのハイブリダイゼーションの際の特異性および選択性の間のバランスを作成するために、長い15と21塩基の間であるように設計されている。 2つの自己相補的なドメインから構成する短いステムは、通常、4塩基であるように設計されている。長いステムが選択されている場合、RBMBループと標的RNAとのハイブリダイゼーションの速度は著しく17,18を減速される。より短いステム配列が選択されたとき、逆に溶融温度が高いバックグラウンドシグナルをもたらす、37℃でステムループ構造を維持するために頻繁に低すぎる。 RBMBの特異性も赤です茎長が短くなるようにuced。 RBMBステム-ループの配列はまた、RBMB性能に影響を与えることができるので、19を慎重に選択しなければならない。具体的には、理想的なループ配列は、最小の二次構造を有するべきである最小の二次構造を有するRNA配列にハイブリダイズし、タンパク質結合部位を回避し、および結合オフターゲットを回避する。 RBMBおよびRNA二次構造の両方の予測は、MFOLD 20などのソフトウェアを使用して得ることができる。コンプリメンタリオフターゲット部位は、ヌクレオチドの基本的なローカル割り付け検索ツール（BLAST）を使用して識別することができます。しかし、モデル予測およびタンパク質入札機関部位を同定することが困難に不整合により、すべてのRBMBsの特異性は、最終的には実験的に検証する必要があります。
望ましい場合には、ハイブリダイゼーション状態の影響を受けない非消光参照色素はRBMB 15に加えることができる。参照色素の添加は、PRができるプローブの配信のためにマーカーをovide全細胞蛍光のより正確な測定が必要な場合は、レシオメトリックイメージングに使用される。リファレンス色素は測定が送達細胞間のばらつきに起因バックグラウンドの差を調整することができる。しかし、個別のRNAを撮像する際は、参照色素を必要としない転写産物。注目すべきことに、いくつかの基準色素は核内でわずかに高いバックグラウンドシグナルをもたらし、核からRBMBsの輸出を妨害する可能性がある。
適切に設計されたときに、標的RNAは、少なくとも4つのRBMB結合部位（ 図1B）16 を含むように操作された場合、RBMBsは、単一の生細胞内の画像個別のRNA転写物に使用することができる。 RBMBsを効率的に細胞生存率21全く影響がほとんどで、マイクロポレーションを介して細胞タイプの広い範囲内に送達することができ、遺伝子発現の定量的測定であることができる30分以内に取得しました。結合していないRBMBsからの蛍光を効率的に消光されるので、方法論は、RBMB濃度と標的RNAのレベルにかなり鈍感である。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の画像化を介して生細胞へRBMBsを準備し、精製するために使用される方法の詳細な説明、ならびにRBMBsの送達のための一般的な手順を提供する。
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Protocol
このプロトコルでは、一つのオリゴヌクレオチド（RBMB1）はCF640Rレポーター色素とその5 '末端で標識され、配列：5'mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mUのmGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC MUMU-3'。ヘアピン構造の形成を推進自己相補的ドメインは、太字で示しています。第二のオリゴヌクレオチド（RBMB2）はアイオワブラックRQ-Spをクエンチャーとの3 '末端で標識され、配列を有した：5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'。
RBMBsの調製
- RBMB1とRBMB2オリゴヌクレオチドを含有するチューブの迅速なスピンを行って、乾燥したオリゴヌクレオチドは、100μMの最終濃度までDNaseおよびRNaseフリー水中のチューブの底、再懸濁にあることを確認します。例えば、オリゴヌクレオチドの10ナノモルサンプルは100μlの水に再懸濁されるべきである。
- [測定URE紫外可視分光法によるRBMB1とRBMB2株式サンプルの正確な濃度。
- マイクロチューブ117μlのDPBS（カルシウム及びマグネシウムを含まない）でRBMBサンプル3μlのを混ぜる。
- DPBSでブランク分光光度計とは、200〜800 nmの吸光度から測定します。注：ピークは260nmでの吸光度から650nmが見えるはずです。
- の式を用いて、260nmの（またはRBMB1 650 nm）における吸光度に基づいてRBMB試料のストック濃度を計算する：
ストック濃度（M）は260で 260 nmでの吸光度と希釈係数が40である260 *希釈係数/吸光係数=。
注：RBMBの吸光係数は、オリゴヌクレオチドの製造元が提供する仕様書に記載されています。 650nmにおけるCF640Rの吸光係数は103,000である。
- 100μMのRBMB120μlの100μMのRBMB230μlの、6μlの10倍を混ぜる;リン酸緩衝液（10×リン酸緩衝液：480mMのK 2 HPO 4、45mMのKH 2 PO 4、140mMのNaH 2 PO 4、pH7.2）で4μlのDNaseおよびRNaseフリー水。 30分間室温で混合物をインキュベートする。注：これは、典型的には、約50の研究のために十分である。
- いずれのハイブリダイズしていないRBMB2オリゴヌクレオチドを除去するために75調製グレードスーパーデックスを用いた液体クロマトグラフィーカラムを準備します。混合プローブの小さな体積を精製する〜4ミリリットルの総容積で8mLの（0.7×20cm）に、液体クロマトグラフィーカラムを使用してください。
- 洗浄を、0.6 ml /分の流速でフローで動作するシリンジポンプを用いて〜1×リン酸緩衝液の50ミリリットルを平衡化したSuperdex。流体のすべてがベッドボリュームに入る前に、それを外し、シリンジポンプを停止し、残りの液体は、重力によってカラムを通過してみましょう。
- クロマトグラフィーカラムにRBMB混合物（60μl）をロードします。
- RBMBサンプルは完全にした後にゆっくりと試料全体が完全にカラムに入ったことを確認するために、ベッドの上部に1×リン酸緩衝液の別の250μlのを追加し、ベッドに入った。
- 1×リン酸緩衝液でリムに列を入力します。上部を閉じて、シリンジポンプを起動 - シリンジ〜50ミリリットル1×PBSを充填した0.6 ml /分の流速で実行されるべきである。
- RBMBたら塔の底部に近づく - RBMBサンプルは一般的に容易に起因するプローブに組み込まれた染料の色に可視化することができる - フロースルー微量遠心チューブあたり2滴（1.5ミリリットル）で収集します。マイクロチューブ内の色が明らかになった時点で、サンプルの収集を停止。
- 通常は5-6チューブ - - 色のRBMBサンプルを含むチューブを組み合わせ、遠心フィルター装置（10,000 MWカットオフ）にロードする。 20分間または所望の体積になるまで万RCFでサンプルを遠心。注：これらの速度と時間は、一般的になります〜30μlの最終容量が得られる。
- 紫外可視分光法により、精製RBMBサンプルの正確な濃度を測定する。
- 濃厚RBMBサンプル3μLを取り、マイクロチューブに117μlのDPBSで混ぜる。
- DPBSでブランク分光光度計とは、200〜800 nmの吸光度から測定します。注：ピークは260nmでの吸光度から650nmが見えるはずです。
- の式を用いて、650nmでの吸光度に基づいて、ハイブリダイズしたRBMBのストック濃度を計算する：
ストック濃度（M）は650で 650 nmの吸光度で650 *希釈係数/絶滅係数=、希釈係数は40である。
注：650nmの時CF640Rの吸光係数は103,000であり、アイオワ州ブラックRQの吸光係数は〜20,000。吸光係数は、添加剤であり、ハイブリダイゼーションは区別されません。したがって、在庫RBMBサンプルはapproximatelの組み合わせ吸光係数を有する650nmでのy 123000。
- 将来の使用のために-20℃での名前と濃度とストアに適切にチューブにラベルを付けます。
8ウェルチェンカバーガラスコーティングされたポリ-D-リジンの調製
- 無菌環境に滅菌水25ml中のポリ-D-リジン（凍結乾燥粉末、g線照射）5mgを溶解することによって、ポリ-D-リジン0.2 mg / mlの溶液を調製する。
- 無菌環境で、8ウェルチャンバーカバーガラスの各ウェルに0.2 mg / mlのポリ-D-リジン溶液200μlを追加します。
- 細胞培養フード内で16〜18時間、室温でインキュベートする。
- ポリ-D-リジンを吸引し、滅菌蒸留水でウェルを3回洗浄する。注：コーティングされたチャンバースライドを4℃で保存することができる。
3プローブ配信
注：使用した細胞系は、少なくとも4順次結合してRNAを発現する統合された遺伝子構築物を含むべきで3 '非翻訳領域（UTR）にRBMBのための部位をる。標的配列はRBMBのループに相補的であるべきである。これは、陰性対照として、同じ細胞株が、タンデムリピートなしで、同じ遺伝子構築物を発現するように操作されることをお勧めします。このプロトコルでは、ヒト線維肉腫細胞株HT1080は、3'-UTRにおけるRBMB標的配列の96タンデムリピートを有するGFPの RNAを発現するように操作した。コントロール細胞株は、野生型GFPの RNAを発現するように操作した。
- 一日のプローブ配達の前40〜50％の集密度でT25フラスコ中で細胞をプレート。培養DMEM培地で細胞を1％のペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FBS）を補充し、そして5％CO 2、37℃でインキュベートする。
- 次の日は、microporatorをオンにし、950 V、2パルス、25ミリ秒に微小穿孔のパラメータを設定してください。注：これらのパラメータは、HT1080細胞のために最適化されてきたが、それらは、細胞型に依存しており、adjusことができます製造業者の取扱説明書に記載されるような他の細胞型のためテッド。
- 4ミリリットルの電解液とのマイクロポチューブを記入し、マイクロポ·ステーションの上に置きます。
- 精製されたRBMBの在庫サンプルを取り出して、それを解凍。 1×リン酸緩衝液で12μMの最終濃度になるように、いくつかのマイクロリットルに希釈する。 1μlを各微小穿孔のために必要とされる。
- ピペットFBSを有するがマイクロ遠心チューブに抗生物質を含まない培養液1ミリリットル。注：これは当分の間、マイクロポ機器の近くで、マイクロポ直後に細胞を懸濁するために使用され、取っておくことができます。培養培地中の抗生物質を含めることは、マイクロポレーション後の細胞生存率を減少させる。
- 一回1ミリリットルのCa 2 +およびMg 2 +を含まないDPBSで細胞を洗浄、操作されたHT1080細胞（60〜80％コンフルエント）から細胞培養培地を取り出し、1〜2分間1ミリリットルトリプシンでインキュベートする。
- trypsinizatioを停止します抗生物質およびフェノールレッドを含まない10％ウシ胎児血清を補充した1ミリリットルDMEM培地を添加すること、および2つの1.5mlのマイクロチューブに細胞を移すことによりn。
- 5分間200×gで遠心チューブ中で細胞をスピンダウン。上清を除去し、再懸濁し、1mlのDPBSの最終体積で細胞ペレットを兼ね備えています。
- よく混合細胞懸濁液から10μLを取り、細胞をカウントします。
- 必ず彼らはよく分散されていることを確認し、新しい1.5 mlのマイクロチューブにDPBSで300,000細胞を転送し、5分間200×gでスピンダウンするには、上下に数回の細胞をピペット。
- 細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を除去します。細胞を十分に分散されることを保証するために11μlの再懸濁緩衝液とピペット最大で数回上下ペレットを再懸濁する。気泡を発生しないように注意してください。注意：空気の泡がマイクロポ中に火花が発生し、貧しいRBMB配信や細胞死をもたらすであろう。
- 希釈されたRBMB（12μM）を1μlを加え、ピペッティングにより数回上下よく混ぜる。ここでも気泡を生成しないように注意してください。
- 吸引除去RBMB細胞液10μl、マイクロポピペットを用いて、マイクロポチューブにピペットを挿入します。マイクロポを開始するには、スタートボタンを押してください。注意：先端には目に見える気泡があってはならない。
- microporatorの画面が完了したことを示している場合には、FBSを1ミリリットルの培養液ではなく、抗生物質を含まない、先に作製したマイクロ遠心チューブに10μlの混合物を排出する、駅からピペットを取り外します。チューブ左右に数回揺動により穏やかに混合します。
- 5分間200×gで細胞をスピンし、細胞内に送達されなかったRBMBsを除去するために、FBSを1ミリリットルのフェノールレッドを含まない培養液ではなく、抗生物質を含まない、細胞をさらに2回洗浄する。 FBSを除いた全ての400μlのフェノールレッドを含まない培養培地で再懸濁抗生物質。
- ポリ-D-リジンへのプレートmicroporated細胞はウェルあたり200μlので、又は所望の密集度で8ウェルチャンバーカバーガラスをコーティングした。
- オプション：それは核イメージすることが望ましい場合、0.01ミリグラム/ mlの最終濃度で細胞にヘキスト33342を追加する。
- 細胞培養インキュベーターにチャンバーカバーガラスを配置します。細胞がカバーガラス表面に落ち着くのに十分な時間を持つように、撮像前に1〜2時間、細胞をインキュベートする。注：イメージングは、30分後にマイクロポとすぐに行うことができる。
4。画像取得
- 生細胞期トップのインキュベーションシステムの電源を入れ、37℃、5％のCO 2、および75％の湿度に達するまで平衡化。
- 顕微鏡と蛍光光源をオンにして、をMetaMorphソフトウェアを開きます。注：顕微鏡制御と画像取得のための他の同様のソフトウェア·パッケージを使用することもできる。
- にImmersolオイルを塗布する目的。
- 生細胞期トップインキュベーションシステムにmicroporated細胞とチャンバーカバーガラスを転送します。温度までステージ天システムをインキュベートし、CO 2レベルが安定化される。
- をMetamorphソフトウェアで、[取得]タブを開きます。 、フィールドを見つけるためにショーのライブボタンをクリックして、白色光の下で焦点を調整し、[停止ライブ]ボタンをクリックします。
- [取得]タブで、クリックして、ストリーム取得ポップアップボタンを開き、目的の映画の収集パラメータを設定します。のCy5 / CF640Rフィルターを使用して150フレームを取得し、ハードドライブに画像を保存します。
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Representative Results
広視野蛍光顕微鏡で画像化する際まもなくRBMBsの存在下で、HT1080細胞のマイクロポ以下、それらの3'-UTR内の複数RBMB結合部位を含むように操作された個別のRNA転写物（ 図2）のように明るい蛍光スポットとして表示されます。わずか4つのRBMB結合部位を有する個別のRNA転写物は、生細胞内で画像化することができるが、3'-UTRにおける結合部位よりRBMB、強い蛍光シグナル。信号は光退色に失われる前にまた、より長い各転写産物に結合しているより多くのRBMBsは、RNAを可視化することができる。このプロトコルでは、RNAは、3'-UTRにおけるRBMB標的配列の96タンデムリピートを含有するように構築された。ストリーミング画像の取得は、個別のRNA転写産物は、リアルタイム（ 動画1）で結像されることを可能にする。個別のRNA転写物は、容易に細胞質および核O内で移動することがわかる細胞F。スポットのほとんどはブラウンまたはサブ拡散運動を受けるように見えるが、まれに向け輸送を受けているRNAは、（ 動画2）観察される。論文のRNA転写物は、一般的に直線路（ 図3）に沿って迅速に移動。しかし、一部のRNAは、湾曲した経路をたどるか、方向の急激な変化を作るのですか。これらの動きは、本質的にランダムであり、ここで取得し、短い時間フレーム（ すなわち <1分）内の小さな全体の変位を示し、ブラウン運動、非常に対照的である。性RNAの動きは、微小管とマイクロフィラメントに沿って、RNAの輸送と一致している。これらの実験は、RBMBsは、生細胞における個別のRNA転写物を画像化するための汎用性と強力なツールを提供することを示している。
フィギュア相補的な標的RNAの存在下および非存在下で1 RBMBsおよび生細胞における方法に用いられる画像個別のRNA転写産物の概略図。A）RBMBs。不在またはターゲットRNAは、RBMB蛍光が消光される。標的RNAの存在下では、RBMB蛍光が回復する。B）複数RBMBs、広視野蛍光顕微鏡で検出することができ、明るい蛍光スポットを作成し、各RNA転写物と結合する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
安定的にAでRNAを発現するHT1080細胞）を96タンデムリピートまたはBの図2。代表画像）におけるRBMB結合部位の4縦列反復3'-UTR、RBMBsの細胞内送達後。 96タンデムリピートの存在は、個別のRNA転写物は、明るい蛍光スポットとして表示することができます。唯一の4タンデムリピートを含むRNAも可視化することができるが、蛍光スポットの強度は非常に暗いと非常に低いバックグラウンドの分野で、多くの場合、唯一の検出可能である。特に輝点の数が少ない動いていないRNAに対応している。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
監督輸送を受けたRNA転写物の3モンタージュ図 。転写産物の軌道は最も左側のパネルに示されている。軌道は、単一のfの上にオーバーレイされている時系列のRAME。スケールバー：2.5μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
安定的RBMBsの細胞内送達の後、3'-UTRにおけるRBMB結合部位の96タンデムリピートを持つRNAを発現するHT1080細胞の作品1。代表のムービー。個別のRNA転写物は、明るい蛍光スポットとして表示されます。スケールバー：10μmのビデオを見るにはここをクリックしてください。
ムービー2に向け輸送を受けて、RNA転写物の代表的な映画。スケールバー：10μmのビデオを見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
従来の広視野顕微鏡を用いて、生きた細胞内の画像の単一設計されたRNA転写する能力は、各RNA転写物と結合していない蛍光プローブから発せられる低蛍光バックグラウンドに関連付けられる、明るく光安定蛍光シグナルを必要とします。この方法では、明るい蛍光シグナルは、各RNA転写物の上に、（96まで）の複数のオリゴヌクレオチドに基づく蛍光プローブ、 すなわち RBMBsをハイブリダイズさせることによって達成される。しかし、わずか4つのバインディングサイトは16で十分です。集団的信号をリアルタイムで追跡することができ、明るい蛍光スポットになる。集合的信号が失われる前に、蛍光色素の実質的な部分を光退色されなければならないので、複数のプローブの存在はまた、より長いイメージング時間を可能にする。なお、この技術は、RNA生物にユニークな洞察を提供し、目の測定範囲のRNAの挙動の広範囲の研究を可能にすることが想定されるさまざまな外部刺激へのRNA輸送の電子応答、RNAの運命と寿命に勉強し、そしてRNA規制への洞察を提供する、標的RNAのユニークな細胞内局在パターンを観察する。それに加えて、RNA発現の変化（ すなわち、アップ及びダウンレギュレーション）を追跡することが可能である。この機能はまだ検証されていないが、私たちは、以前のRNAコピー数はかなり正確に、生細胞22で最大24時間、定量化することができることを示している。また、RBMBsは、遺伝子発現のレベルに影響を与えないように思われる。組み合わせた、これらの結果は、セル単位で、正確に追跡されたこの期間にわたる遺伝子発現に変化し、RBMBsは、RNA安定性の増加につながるか、RNAの分解を遅らせなかったことを最初の証拠を提供する。しかし、すべてであれば、実際にこの時間の間に変化し、どの程度遺伝子発現に明らかではない。
一般的に、それは遺伝子発現の増加を容易に識別することが期待;新たに形成された転写産物を結合して自由である細胞内で結合していないRBMBの豊富さに起因する。しかし、どのようなあまり明確ではないことはRBMBs翻訳および分解中およびRNA発現/分解し、これらの転写産物の撮影の間にいくつかのタイムラグがある場合にはRNAから解離する方法です。さらなる研究がまだ良いこれらのシナリオでのRBMBのパフォーマンスを理解するために必要とされる。
単一のRNA転写物を画像化するためのいくつかの代替的なアプローチは、以前に報告されている。関連する最も初期の研究では、蛍光単離されたRNA転写物を標識し、一般的にマイクロインジェクション23,24によって、細胞内にこれらの転写物を再導入。シグナル対バックグラウンドこのアプローチのが原因任意の未結合の蛍光色素を除去する能力に、非常に高いが、観測されたRNAの挙動を正確にトゥルーを表しているかどうかが懸念され電子のRNA処理を行う。この欠点に対する最も一般的な解決策は、ここで紹介RBMBアプローチに類似した蛍光レポーターに拘束されることができる3'-UTRにおけるタンデムリピートとエンジニアリングの導入遺伝子を含んでいた。以前の蛍光レポーターは、一般的にほうれん草25、およびGFPと呼ばれるRNAアプタマーを、結合時に蛍光を発する小分子が含まれている。ほうれん草は、まだ単一のRNA転写物を撮像するために使用されていないが、画像グローバル表現するために使用されている。対照的に、GFPは、画像を正常に単一のRNA転写物に使用されている。 3'-UTR 2,10におけるMS2結合部位の縦列反復を構築するこの方法では、GFPレポーターは、細菌ファージMS2（GFP-MS2）のコートタンパク質に融合され、操作されたRNAに結合する。このアプローチは、ここで説明されたアプローチに非常に類似しているが、RBMBsはいくつかの利点を提供する。例えば、RBMBsより広いのdivを提供する、有機フルオロフォアは、イメージングのために使用されることを可能に蛍光タンパク質と比較して、優れた光安定性と優れた明るさと選択肢のersity。さらに、近赤外に遠くで発光する多くの市販の有機蛍光団があります。赤方偏移の発光スペクトルを有する色素を選択することの利点は、これらの波長で観測され、下部の細胞の自家蛍光に由来する。自己蛍光の高いレベルを容易RNAハイブリダイゼーションに関連する任意の蛍光シグナルをかき消すことができるので、大幅に自己蛍光を減少させる能力は、信号対バックグラウンドで重要なブーストを提供する。 RBMBsを使用する別の重要な利点は、未結合のプローブからの信号が有意にクエンチされることである。 、さまざまなアプローチは、GFPの発現レベルを制御する、結合していないGFP-MS2アプローチにおけるGFP、 例えば 、核局在化シグナルの使用のバックグラウンド蛍光を減少させるためにとられた、スプリットGFP補完1,10,11,26,27、ものの実際の消光moieの存在RBMB設計内ティはるかに大きな実験的な柔軟性をユーザーに提供します。例えば、RBMBアプローチはRNA発現およびプローブ濃度の相対および総レベルの両方の影響を比較的受けています。実際には、個別の転写産物が一桁に及ぶRBMB濃度で画像化することができる。高い光安定性、明るいシグナル、および低いバックグラウンドを合わせた利点は、限られた専門知識を持つ顕微鏡ユーザーにとってはるかにアクセス可能RBMBsとのリアルタイムのRNAイメージング実験を行う。
おそらく、そのようなRBMBsなどの外因性プローブを使用することの最も顕著な欠点は、GFPなどのレポーター分子とは対照的に、細胞内送達のための必要性である。幸いなことに、多くのオプションが存在し、 例えばマイクロインジェクション28、トランスフェクション剤29、細胞透過性ペプチド30およびストレプトリジンO（SLO）31。個人的には、マイクロポレーションがあることを見出した一般的に> 95％の生存率および送達効率21その結果、ほとんどのユーザーフレンドリーで汎用性の高いオプション。マイクロリットル容量のエレクトロポレーションプロセスは発熱、金属イオン溶出、pHの変動や酸化物の形成を含め、多くの場合、エレクトロポレーションに関連する多くの有害事象における減少を示すので、これは可能性がある。 RBMBsは、単一の実験で> 100,000個の細胞に送達することができるので、重要なことは、マイクロポレーションは、高スループットの研究に適している。
生きた細胞内の画像のRNAの局在や動きにもRBMBsを使用して多くの利点にもかかわらず、制限及び多くの課題が残っている。おそらく、最大の課題は、連続暴露の下で数分以上のためのRNAを追跡することができないことである。これは、光退色焦点撮像面の外に移動するRNAの能力の両方の結果である。明るくより光色素は、アルを助けることができるこれらの欠点の両方leviate、各色素を励起することができる回数を増加させ、個別の蛍光スポットが、焦点面からより大きな距離で撮像することを可能にすることによって。光安定性を増加させる1つの有望なアプローチは、その生涯32を拡張するために有機フルオロフォアに近接消光剤三重項状態を利用する自己修復性染料の使用を含む。別のオプションは、自己クエンチしない接続フルオロフォアの多数で構成されている蛍光増幅共役ポリマーの使用であってもよい。これらのポリマーは、単一の有機フルオロフォアよりも何倍も明るくすることができ、依然として効率的に単一の消光部分33,34によってクエンチする。しかし、この分野での追加的な作業がまだ必要です。それは、それがtであることを確保することが困難であるため、毎秒> 1フレームのフレームレートで間欠的イメージングは、画像に長期間にわたって、単一のRNA転写物を行うことができないことに留意すべきであるフレーム対フレームから追跡されて、彼と同じRNA転写物。もちろん、単一細胞レベルでの遺伝子発現の定量的評価は、セル単位で16,35,36に個別の蛍光スポットの計数を通って、長い時間枠にわたって依然として可能である。この場合には、個別の転写産物を追跡する必要はない。全体的に、それはRBMBsはRNAの機能に重要な洞察を提供することが可能であると考えられ、従来の顕微鏡装置及び制限された専門知識を持つ単一の操作されたRNA転写物の画像化を可能にしている。
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Disclosures
博士マークBehlke博士陵黄は原稿に記載された化合物の一部に類似の販売のためのオリゴヌクレオチドを提供していますどのIDTによって採用されている。 IDTは株式公開企業、しかし、ではない、彼らは個人的には、IDT内の任意の株式/持分を所有していない。
Acknowledgments
この作品は、国立科学財団キャリア賞（0953583）と健康NCI / R21-CA116102総合研究所、NCI / R21-CA125088、NIBIB / R01-EB012065、NCI / R01-CA157766によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 ml |
| Chromatography column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7 x 20 cm |
| Superdex 75 prep grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60 ml, Luer-lok tip |
| Centrifugal filter units | Millipore | UFC501096 | MW 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5 ml |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | 25 cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without phenol red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S.
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
