Summary
Proporsjonal bimolecular beacons (RBMBs) kan brukes til bilde enkelt konstruert RNA transkripsjoner i levende celler. Her beskriver vi forberedelse og rensing av RBMBs, levering av RBMBs inn celler ved microporation og fluorescerende avbildning av enkelt RNA transkripsjoner i sanntid.
Abstract
Den voksende erkjennelse av at både tid og rom regulering av genuttrykk kan ha viktige konsekvenser på cellefunksjonen har ført til utvikling av ulike teknikker for å visualisere enkelte RNA transkripsjoner i én levende celler. En lovende teknikk som nylig har blitt beskrevet, anvender et oligonukleotid-basert optisk sonde, ratiometrisk bimolekylære radiofyr (RBMB), for å påvise RNA-transkripter som ble konstruert for å inneholde minst fire tandem repetisjoner av RBMB target-sekvensen i 3'-ikke-translaterte området. RBMBs er spesielt designet for å avgi en lys fluorescerende signal ved hybridisering til komplementær RNA, men ellers forblir slukket. Bruken av en syntetisk probe ved denne fremgangsmåten gjør det mulig photostable, rød-forskjøvet, og høyst emissive organiske fargestoffer som skal brukes for avbildning. Binding av flere RBMBs til de konstruerte RNA transkripsjoner resultater i diskrete fluorescens flekker sett under et bredt felt fluorescerende mikroskop. Følgelig kan bevegelse av individuelle RNA-transkripter blir lett visualisert i sanntid ved å ta et tidsserie av fluorescerende bilder. Her beskriver vi forberedelse og rensing av RBMBs, levering i cellene ved microporation og live-cell imaging av single RNA transkripsjoner.
Introduction
Uttrykket og regulering av RNA transkripsjoner er en kompleks og dynamisk prosess som er i stor grad ansvarlig for å kontrollere celle atferd og skjebne. Selv om betydningen av RNA i dikterer celle funksjon har vært kjent i noen tid, er det ofte vanskelig å trekke klare sammenhenger mellom de to siden de fleste RNA analyseverktøy mangler romlig og tidsmessig oppløsning kreves for å fange viktige regulatoriske hendelser som transkripsjon sprengning, RNA trafficking, og lokalisert RNA prosessering. Dette har ført til bruk av flere teknikker som gjør at enkelte RNA transkripsjoner å bli visualisert i levende celler i sanntid en. Kanskje den mest fremtredende av disse teknikkene utnytter en GFP-MS2 fusjonsprotein å målrette RNA som er konstruert for å inneholde tandem gjentakelser av MS2 bindingssetet i 3'-UTR 2,3. Ved å bringe flere GFP molekyler i umiddelbar nærhet, synes enkelte RNA transkripsjoner som lyse fluorescerende flekkervia fluorescens mikroskopi. GFP-MS2 system har gitt enestående innsikt i RNA atferd, inkludert direkte visualisering og målinger av transcriptional sprengning 4,5, påvisning av unike sub-cellulær lokalisering og behandling 6-9, og sanntids avbildning av RNA transport 10. Imidlertid, til tross for den enorme potensielle av GFP-MS2-system, kan ubundne GFP-MS2-fusjonsproteiner skape en høy bakgrunn fluorescerende signal som begrenser allsidighet og det dynamiske området for denne teknikken. Flere tilnærminger har blitt utviklet for å begrense denne bakgrunn signal, inkludert subcellulære compartmentalization av ubundet GFP-MS2 10, protein fragment complementation 11, og alternative RNA bindende proteiner og mål 12. Men alle disse metodene være følsom for den relative og total ekspresjon av RNA-target og GFP-MS2-fusjonsprotein.
Som enlternative til GFP-MS2 systemer, har molekylære beacons også blitt brukt til å oppdage konstruert RNA transkripsjoner med tandem gjentakelser av den komplementære bindingssetet i 3'-UTR 13,14. Molekylære radiofyr er hårnål-dannende oligonukleotid-prober som er merket i den ene enden med en quencher, og ved den annen ende med et fluorescerende reporter. Når den ikke er bundet til target RNA den fluorescerende reporter og quencher forbli i tett nærhet, noe som resulterer i en lav-fluorescerende tilstand. Ved hybridisering, er den fluorescerende reporter og drikk tvunget fra hverandre og fluorescens er gjenopprettet. I likhet med GFP-MS2-system, bindingen av flere molekyl beacons på et enkelt RNA-transkripsjon resulterer i en lys fluorescerende flekk som kan identifiseres ved fluorescens mikroskopi; imidlertid er bakgrunnsfluorescens forventet å være mye lavere, på grunn av undertrykket konfigurasjonen av ubundne molekylære radiofyr. Dessverre finnes det, til tross for smart aktiveringsmekanisme som er innlemmet i molecular beacon design, er det nå økende bevis for at uhybridisert molekylære beacons ikke forbli i hårnål konformasjon når introdusert i levende celler. Følgelig, de genererer et falskt positivt signal som i betydelig grad reduserer signal-til-bakgrunn. For å overvinne denne brist, vi nylig utviklet en ny syntetisk probe for bildebehandling RNA i levende celler, Proporsjonellekspansjon bimolecular beacons (RBMBs; Figur 1a) 15,16. RBMBs er sammensatt av to 2'-O-metyl-oligonukleotid-tråder som danner en hybrid struktur med trekk fra både korte hårnål RNA (shRNA) og molekyl signalene. Sløyfen og fluorescens aktiveringsmekanismen er lik den molekylære beacon, mens den lange dobbelt-trådet domene med et 3'-overheng UU er mer karakteristisk for shRNA. De shRNA funksjonene er utformet for å drive kjernefysisk eksport, som vi har funnet øker intracellulær levetid til> 24 timer, med minimal observer degradering, ogforhindrer ikke-spesifikk åpning av sløyfen. Som et resultat RBMBs utviser en betydelig høyere signal-til-bakgrunn enn molekylære beacons.
Det bør bemerkes at RBMBs ikke kan fremstilles ved hjelp av DNA-oligonukleotider, ettersom DNA-baserte prober ikke besitter de samme atom eksport muligheter som RNA-baserte prober. Strukturelt er den RBMB sløyfen typisk utformet til å være mellom 15 og 21 baser lange, for å skape en balanse mellom spesifisitet og selektivitet ved RNA hybridisering. Den korte stammen som danner fra de to selvkomplementære domener er vanligvis laget for å være fire baser. Hvis en lengre stem er valgt, er frekvensen av hybridisering mellom RBMB loop og målet RNA betydelig redusert 17,18. Omvendt, når en kortere stammen sekvens er valgt smeltetemperaturen er ofte for lav til å opprettholde stammesløyfestrukturen ved 37 ° C, som fører til et høyt bakgrunnssignal. Spesifisiteten av RBMB er også røduced som stammen lengde forkortes. Siden sekvensen av RBMB stem-sløyfe kan også påvirke RBMB ytelse, må det nøye utvalgt 19. Særlig bør ideelt sløyfe sekvenser ha minimal sekundær struktur, hybridisere til RNA-sekvenser med minimal sekundær struktur, unngå proteinbindingsseter, og unngå off-target-binding. Spådommer om både RBMB og RNA sekundærstruktur kan oppnås ved hjelp av programvare som mfold 20. Komplementære off-target områder kan identifiseres ved hjelp av en nukleotid Basic Local Assignment Search Tool (BLAST). Men på grunn av uoverensstemmelser i modellprediksjoner og vanskeligheter med å identifisere protein avventende nettsider, spesifisitet av alle RBMBs må til slutt godkjennes eksperimentelt.
Hvis ønskelig, kan en unquenched referanse fargestoff som er ufølsom for hybridisering tilstand tilsettes til RBMB 15.. Tillegg av en referanse fargestoff kan provide en markør for probe levering og brukes for ratiometrisk bildebehandling, hvis mer nøyaktige målinger av totalt celle fluorescens er påkrevd. Referansefargestoffer tillater målinger å bli justert for forskjeller i bakgrunnen på grunn av celle-til-celle-variasjoner i leveransen. Imidlertid, når avbildning individuelle RNA-transkripter referanse fargestoff er ikke nødvendig. Spesielt, kan noen referansefargestoffer interferere med utførsel av RBMBs fra kjernen, fører til en noe høyere bakgrunnssignalet i kjernen.
Når utformet på riktig måte, kan RBMBs brukes til bilde individuelle RNA-transkripter i enkelt levende celler, hvis target RNA er konstruert for å inneholde minst fire RBMB bindingsseter (Figur 1b) 16. RBMBs effektivt kan leveres til et bredt spekter av celler typer via microporation, med liten eller ingen virkning på cellelevedyktighet 21, og kvantitative målinger av genekspresjon kan blierverves i løpet av 30 min. Dessuten er metoden ganske ufølsom for RBMB konsentrasjon og target RNA-nivå, siden fluorescens fra ubundne RBMBs er effektivt undertrykket. Her vi gi en detaljert beskrivelse av metodene som er brukt til å forberede og rense RBMBs, samt en generell fremgangsmåte for levering av RBMBs inn i levende celler via microporation og avbildning av enkelt RNA-transkripter i sanntid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne protokollen, ble en oligonukleotid (RBMB1) merket på sitt 5'-enden med en CF640R reporter fargestoff og har sekvensen: 5'- mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 '. Selv utfyllende domener, som driver dannelsen av hårnål struktur, er i fet skrift. Det andre oligonukleotidet (RBMB2) ble merket i 3'-enden med en Iowa-Sp Sort RQ quencher og har sekvensen: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 '.
1. Utarbeidelse av RBMBs
- Utfør en hurtigsentrifugering av rørene som inneholder RBMB1 og RBMB2 oligonukleotider, for å sikre tørket oligonukleotidet er på bunnen av røret, og resuspender i DNase og RNase-fritt vann til en sluttkonsentrasjon på 100 uM. For eksempel bør en 10 nmol prøve av oligonukleotid blir resuspendert i 100 pl vann.
- Måleure den nøyaktige konsentrasjonen av RBMB1 og RBMB2 lager prøver ved UV-vis spektroskopi.
- Bland med 3 pl av den RBMB prøven med 117 ul DPBS (uten kalsium og magnesium) i et mikrosentrifugerør.
- Blank spektrofotometeret med DPBS og måle absorbans 200-800 nm. Merk: Peak absorbansene ved 260 nm og 650 nm skal være synlig.
- Beregn lager konsentrasjonen av RBMB prøver basert på absorbansen ved 260 nm (eller 650 nm for RBMB1), ved hjelp av ligningen:
Stock Konsentrasjon (M) = A 260 * fortynningsfaktoren / ekstinksjonskoeffisient der A 260 er absorbansen ved 260 nm og fortynningsfaktoren 40.
Merk: ekstinksjonskoeffisient for RBMB kan bli funnet på spesifikasjonsarket levert av oligonukleotid produsenten. Den ekstinksjonskoeffisient av CF640R ved 650 nm er 103.000.
- Bland 20 ul av 100 uM RBMB1, 30 pl av 100 pM RBMB2, 6 mikroliter 10x; Fosfatbuffer (10x fosfatbuffer: 480 mM K HPO 2 4, 45 mM KH PO 2 4, 140 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) og 4 pl DNase og RNase-fritt vann. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 min. Merk: Dette er vanligvis tilstrekkelig for ca 50 studier.
- Forbered en væskekromatografi kolonne med 75 prep grade Superdex å fjerne eventuelle uhybridiserte RBMB2 oligonukleotider. Bruke en 8 ml (0,7 x 20 cm) væskekromatografi kolonne med en ~ 4 ml lagvolum å rense lite volum av blandede prober.
- Vask og likevekt på Superdex med ~ 50 ml 1 x fosfatbuffer ved hjelp av en sprøytepumpe i gang ved en strømnings ved en strømningshastighet på 0,6 ml / min. Før alt av fluidet entrer volumet seng, stoppe sprøytepumpen, løsne den, og la det resterende væske går gjennom kolonnen ved hjelp av gravitasjon.
- Last inn RBMB blandingen (60 pl) på kromatografikolonne.
- Etter RBMB prøven har heltangitt sengen, langsomt legge ytterligere 250fil 1x fosfatbuffer til toppen av sengen for å sikre at hele prøven har fullstendig angitt i kolonnen.
- Fyll kolonnen til randen med 1x fosfatbuffer. Lukk topp, og starte sprøytepumpen - sprøyten skal fylles med ~ 50 ml 1x PBS og kjøre med en strømningshastighet på 0,6 ml / min.
- Når RBMB nærmer seg bunnen av kolonnen - den RBMB prøven kan vanligvis lett visualiseres på grunn av fargen av fargestoffet innlemmes i proben - samle gjennomstrømning på 2 dråper pr mikrosentrifugerør (1,5 ml). Slutte å samle prøven når fargen innenfor mikrosentrifugerør blir klart.
- Kombiner de rør inneholdende den fargede RBMB prøven - vanligvis 5-6 rør - og laste inn i et syklonfilter anordning (10,000 MW cut-off). Sentrifuger prøven ved 10 000 RCF i 20 minutter eller inntil det ønskede volum. Merk: Disse hastigheter og tider vil typiskgi et sluttvolum på ~ 30 mL.
- Måle den nøyaktige konsentrasjon av det rensede RBMB prøven ved UV-Vis-spektroskopi.
- Ta 3 mL av konsentrert RBMB prøven og bland med 117 mL DPBS i en mikrosentrifuge tube.
- Blank spektrofotometeret med DPBS og måle absorbans 200-800 nm. Merk: Peak absorbansene ved 260 nm og 650 nm skal være synlig.
- Beregn lager konsentrasjonen av den hybridiserte RBMB basert på absorbansen ved 650 nm, ved hjelp av ligningen:
Stock Konsentrasjon (M) = A 650 * fortynningsfaktoren / utdødd koeffisient der A 650 er absorbans ved 650 nm, er fortynningsfaktoren 40.
Merk: ekstinksjonskoeffisient for CF640R på 650nm er 103.000 og ekstinksjonskoeffisient for Iowa Svart RQ er ~ 20.000. Ekstinksjonskoeffisientene er additive og ikke er følsom for hybridisering. Derfor har aksje RBMB sample en kombinert ekstinksjonskoeffisient av approximately 123000 ved 650 nm.
- Merke røret hensiktsmessig med navn og konsentrasjon og oppbevar ved -20 ° C for senere bruk.
2. Utarbeidelse av Poly-d-lysin Coated 8-vel Chambered dekkglass
- Tilbered en 0,2 mg / ml oppløsning av poly-D-lysin ved å oppløse 5 mg av poly-D-lysin (lyofilisert pulver, g-bestrålt) i 25 ml sterilisert vann i et sterilt miljø.
- Tilsett 200 pl av 0,2 mg / ml poly-D-lysin-løsning til hver brønn av en 8-vel kamret dekkglass, i et sterilt miljø.
- Inkuber ved romtemperatur i 16 til 18 timer i hetten cellekultur.
- Aspirer Poly-D-lysin og vaskes godt med 3 ganger med sterilt destillert vann. Merk: De belagte kammer lysbilder kan lagres ved 4 ° C.
3. Probe Levering
Merk: Det cellesystem som benyttes bør inneholde en integrert genkonstruksjon som uttrykker RNA med minst 4-sekvensiell binding områder for RBMB i det 3'-ikke-translatert region (UTR). De målsekvenser skal være komplementær til løkken på RBMB. Det anbefales at som en negativ kontroll, den samme cellelinje bli konstruert til å uttrykke det samme genkonstruksjon, men uten de tandem repetisjoner. I denne protokollen, en menneskelig fibrosarcoma cellelinje, HT1080, ble utviklet for å uttrykke GFP RNA med 96-tandem gjentakelser av RBMB target sekvensen i 3'-UTR. Den kontrollcellelinje ble konstruert for å uttrykke vill-type RNA GFP.
- Plate-celler i en T25 kolbe ved 40-50% konfluens én dag før sonden levering. Kultur cellene med DMEM medier supplert med 1% pen / strep, og 10% føtalt bovint serum (FBS), og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
- Den neste dagen, slå på microporator og sette opp microporation parametrene til 950 V, 2 pulser, 25 msek. Merk: Disse parameterne er optimalisert for HT1080 celler, men de er celle-type avhengig og kan være adjusted for andre celletyper som beskrevet i produsentens instruksjoner.
- Fyll microporation tube med 4 ml elektrolytisk buffer og plassere den på microporation stasjonen.
- Ta ut aksje prøve av renset RBMB og tine den. Fortynn flere mikroliter til en endelig konsentrasjon på 12 uM med 1x fosfatbuffer. 1 pl er nødvendig for hvert microporation.
- Pipetter 1 ml kulturmedium med FBS, men uten antibiotika i et mikrosentrifugerør. Merk: Dette vil bli brukt til å suspendere cellene umiddelbart etter microporation og kan bli satt til side, nær microporation enhet, for tiden. Inkludering av antibiotika i kulturmedia vil redusere cellenes levedyktighet etter microporation.
- Ta av cellekultur medier fra konstruerte HT1080 celler (60-80% konfluent), vaske cellene med 1 ml Ca 2 + og Mg 2 + -fri DPBS gang, og inkuber med 1 ml trypsin for 1-2 min.
- Stopp trypsinization ved å tilsette 1 ml DMEM medier supplert med 10% føtalt bovint serum, uten antibiotika og fenolrødt, og overføre cellene til to 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Spinn ned cellene i mikrosentrifugerør ved 200 xg i 5 min. Fjern supernatanten, resuspender og kombinere cellepelletene i et sluttvolum på 1 ml DPBS.
- Ta 10 ul fra den godt blandede cellesuspensjonen og telle cellene.
- Pipette cellene opp og ned flere ganger for å sørge for at de er godt spredt og overføre 300.000 celler med DPBS inn i en ny 1.5 ml mikro tube og spinne ned ved 200 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten, være forsiktig for ikke å forstyrre cellen pellet. Resuspender pelleten i 11 pl buffer og resuspensjon pipette opp og ned flere ganger for å sikre at cellene er godt dispergert. Pass på å ikke generere noen luftbobler. Merk: Luftbobler vil føre til en gnist under microporation og resultere i dårlig RBMB levering og celledød.
- Tilsett 1 pl av den fortynnede RBMB (12 uM) og bland godt ved å pipettere opp og ned flere ganger. Igjen være forsiktig for ikke å generere noen luftbobler.
- Aspirer 10 mL av RBMB-celleblanding, ved hjelp av microporation pipette, og sett pipetten inn i microporation tube. Trykk på startknappen for å starte microporation. Merk: Det skal ikke være noen synlige luftbobler i spissen.
- Når skjermen på microporator viser ferdigstillelse, fjerne pipetten fra stasjonen, utvise 10 mL blandingen i mikrorøret som ble utarbeidet tidligere, med 1 ml kultur medium med FBS, men uten antibiotika. Bland forsiktig ved at røret rystes side-til-side flere ganger.
- Spin cellene ved 200 xg i 5 minutter og vaskes cellene to ganger i 1 ml fenolrødt fritt kulturmedium med FBS, men uten antibiotika, for å fjerne eventuelle RBMBs som ikke ble levert inn i cellene. Resuspender med 400 pl fenol rød fritt kulturmedium med FBS, men utenantibiotika.
- Plate de microporated celler inn i Poly-D-lysin belagt 8-vel kamret dekkglass på 200 mikroliter per brønn eller på ønsket konfluens.
- Valgfritt: Hvis det er ønskelig å avbilde kjernen, tilsett Hoescht 33.342 til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 0,01 mg / ml.
- Plasser kamret dekkglass i en cellekultur inkubator. Inkuber cellene i 1-2 timer før avbildning, slik at cellene har tilstrekkelig tid til å slå seg ned på dekkglass overflate. Merk: Imaging kan utføres så snart 30 min post-microporation.
4. Image Acquisition
- Slå på levende celle stadiet toppen inkubasjon system og likevekt den før den når 37 ° C, 5% CO 2, og 75% luftfuktighet.
- Slå på mikroskopet og fluorescerende lyskilde og åpne Metamorph programvare. Merk: Andre lignende programvarepakker for mikroskop-kontroll og bildeoverføring også kan brukes.
- Påfør Immersol olje tilobjektiv.
- Overfør kamret dekkglass med microporated celler til live cellestadiet toppen inkubasjon system. Inkuber trinns topp-systemet til temperaturen og CO2-nivåene er stabilisert.
- Åpne kategorien Acquire, i Metamorph programvare. Klikk på Show Live-knappen for å finne feltet, justere fokus under hvitt lys og klikk på Stopp Live-knappen.
- Under fanen Acquire, klikke og åpne bekken oppkjøpet pop-opp-knappen, og sette opp de ønskede filmen oppkjøps parametere. Erverve 150 rammen med Cy5 / CF640R filter og lagre bildene på harddisken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort tid etter at microporation av HT1080-celler i nærvær av RBMBs, til individuelle RNA-transkripter som ble konstruert inneholde flere RBMB bindingsseter i sin 3'-UTR vises som lyse fluorescerende flekker når avbildes med vid-feltet fluorescensmikroskopi (figur 2). Mens individuelle RNA-transkripter med så få som fire RBMB bindingsseter kan bli avbildet i levende celler, jo mer RBMB bindingsseter i det 3'-UTR, jo sterkere det fluorescerende signal. Dessuten, jo flere RBMBs som er bundet til hvert transkript jo lenger RNA kan visualiseres før signalet går tapt på grunn av fotobleking. I denne protokollen, ble RNA konstruert for å inneholde 96 tandem-repetisjoner av RBMB target-sekvensen i 3'-UTR. Oppkjøpet av streaming bilder lar enkelte RNA transkripsjoner for å bli avbildet i sanntid (Movie 1). Individuelle RNA-transkripter kan lett sees i bevegelse inne i cytoplasma og cellekjernen of cellene. Mens de fleste av stedene synes å gjennomgå Brownske eller sub-diffusiv bevegelser, i sjeldne tilfeller en RNA under rettet transport vil bli observert (Movie 2). Teser RNA transkripsjoner vanligvis beveger seg raskt langs en rett bane (figur 3); Men noen RNA følge buede baner eller gjøre brå endringer i retning. Disse bevegelsene er i skarp kontrast til Brownske bevegelser, som er tilfeldig i naturen og utviser liten samlet forskyvninger innenfor korte tidsrammer ervervet her (dvs. <1 min). De rettet RNA bevegelser er konsistent med transport av RNA langs mikrotubuli og microfilaments. Disse eksperimentene viser at RBMBs gi en allsidig og robust verktøy for å avbilde individuelle RNA transkripsjoner i levende celler.
Figur1. Skjematisk av RBMBs og metodene som er brukt bilde enkelte RNA transkripsjoner i levende celler. A) RBMBs i nærvær og fravær av komplementære mål RNA. I fravær eller target RNA, er RBMB fluorescens bråkjølt. I nærvær av målet RNA, er RBMB fluorescens gjenopprettet. B) Flere RBMBs binde hver RNA transkripsjon skape en lys fluorescerende spot som kan oppdages av wide-feltet fluorescens mikroskopi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representant bilde av HT1080 celler stabilt uttrykker RNA med A) 96-tandem repetisjoner eller B) 4-tandem gjentakelser av RBMB bindingssete i3'-UTR, etter intracellulær levering av RBMBs. Tilstedeværelsen av 96-tandem repetisjoner gjør at enkelte RNA transkripsjoner å fremstå som lyse fluorescerende flekker. RNA som bare inneholder 4-tandem repetisjoner kan også visualiseres, men intensiteten av fluorescerende flekker er meget svak og ofte bare påvisbar i områder med eksepsjonelt lav bakgrunn. Det lille antallet spesielt lyspunkter tilsvarer RNA som ikke er i bevegelse. Målestokk:. 10 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Montasje en RNA transkripsjon gjennomgår rettet transport. Banen til transkripsjon vises i venstre mest panel. Banen er belagt over et enkelt frame av tidsserien. Målestokk:. 2,5 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie 1. Representant film av HT1080 celler stabilt uttrykker RNA med 96-tandem gjentakelser av RBMB bindested i 3'-UTR, etter den intracellulære levering av RBMBs. Individuelle RNA transkripsjoner vises som lyse fluorescerende flekker. Målestokk:. 10 mm Klikk her for å se video.
Movie 2. Representant film av et RNA transkripsjon gjennomgår rettet transport. Målestokk:. 10 mm Klikk her for å se video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å danne bilde enkle konstruerte RNA-transkripter i levende celler ved hjelp av en konvensjonell bred-feltet mikroskop krever en lys og photostable fluorescerende signal for å være assosiert med hvert RNA-transkript og en lav fluorescerende bakgrunns kommer fra ubundne fluorescerende prober. I denne metoden blir et fluorescent signal oppnådd ved hybridisering flere (opptil 96) av oligonukleotid-basert fluorescerende prober, dvs. RBMBs, på hver RNA-transkript. Men så få som fire bindinger nettsteder er tilstrekkelig 16. De kollektive signaler resultere i en lys fluorescerende spot som kan spores i sanntid. Tilstedeværelsen av multiple sonder gjør det også for lengre avbildnings ganger, siden en betydelig del av de fluorescerende fargestoffer må være photobleached før det kollektive signal går tapt. Det er tenkt at denne teknikk vil gi en unik innsikt i RNA biologi og tillate for studiet av en rekke RNA-oppførsel som strekker seg fra måle the respons av RNA menneskehandel til ulike ytre stimuli, observere unike subcellulære lokaliseringsmønstre target RNA, som studerer skjebnen og levetiden RNA, og gir innsikt i RNA regulering. I tillegg kan det være mulig å spore endringer (dvs. opp-og nedregulering) i RNA-ekspresjon. Selv om denne muligheten ennå ikke er validert, har vi tidligere vist at RNA kopi nummeret kan ganske nøyaktig kvantifisert i opptil 24 timer i levende celler 22. Videre trenger RBMBs ikke ut til å påvirke nivået av genekspresjon. Sammen gir disse resultater gir bevis for innledende at endringer i genekspresjon i løpet av denne tidsperioden ble nøyaktig fulgt, på en celle-for-celle-basis, og at RBMBs ikke førte til en økning i RNA stabilitet eller redusert RNA-degradering. Det er imidlertid ikke klart i hvilken utstrekning genekspresjon faktisk endret i løpet av denne tiden hvis i det hele tatt.
Generelt er detventes at hvilken som helst økning i genekspresjon vil lett identifiseres; på grunn av den mengde av ikke-bundet RBMB i cellen som er fritt til å binde nylig dannede transkripter. Men hva som er mindre klart, er hvordan RBMBs distansere seg fra RNA under oversettelse og fornedrelse, og hvis det er noen lag mellom RNA uttrykk / degradering og avbildning av disse transkripsjoner. Ytterligere studier er fortsatt nødvendig for å bedre forstå RBMB ytelse i disse scenariene.
Flere alternative tilnærminger til avbildning enkelt RNA-transkripter har tidligere blitt rapportert. De tidligste studiene involvert fluorescently merking isolert RNA transkripsjoner og re-introdusere disse transkripsjoner inn i celler, for eksempel ved mikroinjeksjon 23,24. Den signal-til-bakgrunn med denne tilnærmingen er meget høy, på grunn av evnen til å fjerne eventuelle ubundne fluorescerende fargestoffer, men det er bekymring over hvorvidt den observerte oppførsel RNA nøyaktig representerer true RNA prosessering. Den vanligste løsningen på dette brist har involvert ingeniørtransgener med tandem gjentar i 3'-UTR som kan være bundet av et fluorescerende reporter, analog til RBMB tilnærming som presenteres her. Tidligere fluorescerende reportere har tatt små molekyler som bare fluorescere på bindende RNA aptamerer, ofte referert til som spinat 25, og GFP. Spinat har ennå ikke blitt brukt til bildebehandling enkle RNA transkripsjoner, men har blitt brukt til bilde global uttrykk. I kontrast, har GFP blitt brukt til å lykkes bilde enkle RNA transkripsjoner. I denne fremgangsmåten blir en GFP reporter kondensert til belegge protein av bakteriell fag-MS2 (GFP-MS2), og binder seg til en konstruert RNA konstruere med tandem repetisjoner av MS2-bindingssetet i det 3'-UTR 2,10. Mens denne tilnærmingen er svært lik den tilnærmingen som er beskrevet her, RBMBs tilbyr flere fordeler. For eksempel RBMBs tillate organiske fluoroforer som skal brukes for avbildning, noe som gir et bredere diversity valg med overlegen fotostabilitet og overlegen lysstyrke sammenlignet med fluorescerende proteiner. Videre er det mange kommersielt tilgjengelige organiske fluoroforer som avgir i langt til nær-infrarøde. Fordelen med å velge fargestoffer med rød-forskjøvet utslipps spektre stammer fra nedre cellular autofluorescence observert ved disse bølgelengdene. Siden høye nivåer av autofluorescens lett kan overdøve eventuelle fluorescerende signaler forbundet med RNA-hybridisering, evnen til å dramatisk redusere autofluorescens gir en viktig økning i signal-til-bakgrunn. En annen viktig fordel med å bruke RBMBs er at signalet fra ubundne prober er betydelig undertrykket. Selv, har ulike tilnærminger er tatt for å redusere bakgrunnen fluorescens av ubundet GFP i GFP-ms2 tilnærming, for eksempel ved bruk av kjernefysiske lokaliseringssignaler, kontrollerende GFP uttrykk nivåer, og split GFP complementation 1,10,11,26,27, den nærvær av en faktisk slukke Moiety innenfor RBMB design gir brukerne mye større eksperimentell fleksibilitet. For eksempel er den RBMB tilnærming relativt ufølsom for både relativ og totale nivå av RNA-ekspresjon og probe-konsentrasjon. Faktisk, kan individuelle transkripter avbildes med RBMB konsentrasjoner som strekker seg over en størrelsesorden. De samlede fordelene ved høyere fotostabilitet, lysere signal, og lavere bakgrunn gjøre sanntid RNA bildebehandling eksperimenter med RBMBs langt mer tilgjengelige for mikros brukere med begrenset kompetanse.
Kanskje de mest bemerkelsesverdige ulempe med å bruke eksogene prober som RBMBs, i motsetning til en molekyl reporter som GFP, er behovet for intracellulær levering. Heldigvis, en rekke alternativer finnes, for eksempel mikroinjeksjon 28, transfeksjon agenter 29, celletrengende peptider 30, og streptolysin O (SLO) 31. Personlig, har vi funnet ut at microporation erden mest brukervennlige og allsidige alternativet, vanligvis resulterer i> 95% levedyktighet og leveringsdyktighet 21. Dette er sannsynligvis fordi mikroliter volum electroporation prosessen utviser en reduksjon i de mange skadelige hendelser som ofte forbindes med elektroporering, inkludert varmeutvikling, metallion oppløsning, pH variasjon og oksyddannelse. Viktigere, er microporation også mottagelig for high-throughput studier, siden RBMBs kan leveres inn> 100 000 celler i et enkelt eksperiment.
Til tross for de mange fordelene ved å bruke RBMBs til bilde RNA lokalisering og bevegelse i levende celler, en rekke begrensninger og utfordringer fortsatt. Kanskje er den største utfordringen manglende evne til å spore RNA for mer enn noen få minutter under kontinuerlig eksponering. Dette er en følge av både fotobleking og evnen til RNA til å bevege seg ut av det sentrale avbildningsplanet. Lysere og mer photostable fargestoffer kan hjelpe alleviate begge disse mangler, ved å øke antallet av ganger hver fargestoff kan være spent og at de adskilte fluorescerende flekker som skal bli avbildet i større avstand fra fokalplanet. En lovende tilnærming for å øke fotostabilitet innebærer bruk av selvhelbredende fargestoffer, som utnytter triplett-tilstand quenchers i nærhet til den organiske fluoroforen for å forlenge deres levetid i 32. Et annet alternativ kan være å bruke fluorescerende forsterker konjugerte polymerer, som er sammensatt av et stort antall tilkoblede fluoroforer som ikke selv-slukke. Disse polymerer kan være mange ganger sterkere enn enkle organiske fluoroforer og likevel bli effektivt undertrykket ved en enkelt rest quenching 33,34; Imidlertid, er ekstra arbeid på dette området fortsatt nødvendig. Det bør bemerkes at vend avbildning, med en bildefrekvens> 1 ramme per sekund, kan ikke utføres i en enkelt bilde RNA transkript over lengre tid, fordi det er vanskelig å sikre at den er than samme RNA transkript som spores fra ramme til ramme. Selvfølgelig er kvantitativ evaluering av genekspresjon på celle-nivået fremdeles mulig over lange tidsperioder, ved telling av de enkelte fluorescerende flekker på en per celle basis 16,35,36. I dette tilfellet er det ikke nødvendig å holde styr på de enkelte transkripter. Totalt sett er det antatt at RBMBs er i stand til å gi viktig innsikt i RNA funksjon og muliggjør avbildning av enkelt konstruerte RNA transkripsjoner med konvensjonell mikros utstyr og begrenset kompetanse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Mark Behlke og Dr. Ling Huang er ansatt av IDT som tilbyr oligonukleotider for salg ligner på noen av forbindelsene beskrevet i manuskriptet. IDT er imidlertid ikke et børsnotert selskap og de personlig ikke eier noen aksjer / egenkapital i IDT.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation KARRIERE Award (0953583) og National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 ml |
| Chromatography column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7 x 20 cm |
| Superdex 75 prep grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60 ml, Luer-lok tip |
| Centrifugal filter units | Millipore | UFC501096 | MW 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5 ml |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | 25 cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without phenol red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S.
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
