Luciferase गतिविधि के माध्यम से रिसेप्टर सक्रियण के मापन: स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर्स की उच्च throughput विश्लेषण
Summary
घ्राण रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न गंध पहचान सांकेतिक शब्दों में बदलना, लेकिन स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर्स के लिए odorant ligands पहचान प्रकाशित डेटा की कमी गंध कोडिंग के लिए एक व्यापक मॉडल के विकास hinders. इस प्रोटोकॉल घ्राण रिसेप्टर ligands और रिसेप्टर सक्रियण की मात्रा का ठहराव के उच्च throughput पहचान की सुविधा के लिए एक विधि का वर्णन करता है.
Abstract
Odorants लगभग 1,000 murine और 400 मानव रिसेप्टर्स के एक परिवार odorants के हजारों पहचान करने के लिए अनुमति देता है, घ्राण रिसेप्टर सक्रियण की अनोखी और अतिव्यापी पैटर्न बना. Odorant ligands मानव रिसेप्टर्स 1-11 के कम से कम 6% के लिए प्रकाशित किया गया है. आंकड़ों के इस अभाव के हिस्से में कार्यात्मक heterologous सिस्टम में इन रिसेप्टर्स व्यक्त कठिनाइयों की वजह से है. यहाँ, हम एक luciferase संवाददाता परख का उपयोग घ्राण रिसेप्टर सक्रियण के उच्च throughput मूल्यांकन द्वारा पीछा Hana3A कोशिकाओं में घ्राण रिसेप्टर परिवार के बहुमत व्यक्त करने के लिए एक विधि का वर्णन. यह परख घ्राण रिसेप्टर्स के पैनल के खिलाफ odorants की (1) स्क्रीन पैनल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; (2) खुराक प्रतिक्रिया घटता के माध्यम से odorant / रिसेप्टर बातचीत की पुष्टि; और (3) रिसेप्टर वेरिएंट के बीच रिसेप्टर सक्रियण के स्तर की तुलना करें. हमारे नमूना डेटा में, 328 घ्राण रिसेप्टर्स 26 odorants के खिलाफ जांच की गई. अलग प्रतिक्रिया स्कोर के साथ odorant / रिसेप्टर जोड़े selec थेटेड और खुराक प्रतिक्रिया में परीक्षण किया गया. ये आंकड़े एक स्क्रीन, एक odorant के लिए एक वास्तविक संपत्ति प्रतिक्रिया है कि यानी रिसेप्टर्स एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग समाप्त हो जाएगी कि odorant / रिसेप्टर जोड़े के लिए समृद्ध करने के लिए एक प्रभावी तरीका है कि संकेत मिलता है. इसलिए, यह उच्च throughput luciferase परख स्तनधारी घ्राण प्रणाली में गंध कोडिंग के एक मॉडल की ओर घ्राण रिसेप्टर्स-एक आवश्यक कदम चिह्नित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है.
Introduction
स्तनधारी घ्राण प्रणाली का पता लगाने और odorants के हजारों के भेदभाव के लिए अनुमति देता है, सुगंधित उत्तेजनाओं की एक बड़ी संख्या के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता है. घ्राण रिसेप्टर्स (ओआरएस) घ्राण उपकला 12 में घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त की आणविक सेंसर कर रहे हैं. स्तनधारी गंध मान्यता odorants द्वारा अन्य रैंकों के अंतर सक्रियण के माध्यम से होता है, और या जीन परिवार मोटे तौर पर 1,000 murine और 400 मानव रिसेप्टर्स 12-16 से, व्यापक है. घ्राण न्यूरॉन्स में और heterologous कोशिकाओं में अन्य रैंकों के पिछले कार्यात्मक विश्लेषण अलग odorants अनूठा द्वारा मान्यता प्राप्त कर रहे हैं दिखाया, लेकिन अन्य रैंकों 10,17-20 ensembles में ओवरलैपिंग है. अन्य रैंकों को ligands मिलान घ्राण कोड और गंध की व्यवहार्य मॉडल के निर्माण के लिए आवश्यक समझने के लिए महत्वपूर्ण है. कारण odorants और अन्य रैंकों दोनों की बड़ी संख्या के साथ ही heterologous सिस्टम में अन्य रैंकों व्यक्त कठिनाइयों को, इस डेटा एफ से काफी हद तक अनुपस्थित कर दिया गया हैield; दरअसल, मानव अन्य रैंकों के कम से कम 6% एक प्रकाशित ligand 1-11 है. इस प्रोटोकॉल odorant / या बातचीत करने के लिए चिह्नित एक luciferase परख के उपयोग का वर्णन करता है. यह परख अन्य रैंकों के उच्च throughput लक्षण, odorant / या बातचीत को समझने के साथ ही गंध कोडिंग का एक मॉडल विकसित करने के लिए आवश्यक है कि किसी कार्य के लिए सक्षम बनाता है.
अन्य रैंकों के उच्च throughput पढ़ाई तीन प्रमुख चुनौतियों का सामना करते हैं. सबसे पहले, heterologous कोशिकाओं में व्यक्त अन्य रैंकों ईआर में बनाए रखा गया और बाद में परख प्रणाली 23-25 में odorants के साथ बातचीत से अन्य रैंकों को रोकने, एंटीबॉडी 21,22 में अपमानित. यह समस्या अन्य रैंकों 19,26,27 के एक विस्तृत रेंज के स्थिर सेल सतह अभिव्यक्ति की सुविधा है कि गौण प्रोटीन की खोज ने भी संबोधित किया. रिसेप्टर ट्रांसपोर्टर प्रोटीन 1 और 2 (RTP1 और 2) को बढ़ावा देने या odorant उत्तेजना 19 के जवाब में सेल सतह अभिव्यक्ति और सक्रियण. इस काम के आधार पर, HEK293T कोशिकाओं थेstably Hana3A सेल लाइन 19,27, जिसके परिणामस्वरूप RTP1 लंबी (RTP1L) और RTP2, रिसेप्टर अभिव्यक्ति बढ़ाने प्रोटीन 1, और जी αolf व्यक्त करने के लिए संशोधित. इसके अलावा, 3 प्रकार मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर (एम 3-R) कोशिका की सतह पर अन्य रैंकों के साथ सूचना का आदान प्रदान और odorants 26 के जवाब में सक्रियण को बढ़ाता है. कोशिका की सतह 27 अन्य रैंकों के एक विस्तृत रेंज के मजबूत, संगत, और कार्यात्मक अभिव्यक्ति में Hana3A कोशिकाओं के परिणाम में RTP1S और एम 3-R के साथ एक या सह अभिकर्मक. दूसरा, स्तनधारी या repertoires काफी बड़े हैं. मनुष्यों में, उदाहरण के लिए, या प्रदर्शनों की सूची स्वाद रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची से अधिक कई परिमाण के एक आदेश है, और दृश्य रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची से अधिक कई परिमाण के 2 आदेश. एक एकल क्लोनिंग या एक अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल है, महत्वपूर्ण अप सामने प्रयास एक व्यापक पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. हम दृष्टि में पता चला है कि हालांकि तीसरा, तरंगदैर्ध्य रंग में तब्दील हो औरऑडिशन आवृत्ति पिच में तब्दील में, odors के संगठन खराब यह मुश्किल शोधकर्ताओं odorants का एक प्रतिनिधि नमूने से बैठाना के लिए बना समझा जाता है. कुछ प्रगति इस मोर्चे 10,28 पर बना दिया गया है, घ्राण परिदृश्य का नक्शा अधूरा रहता है. अन्य रैंकों के सैकड़ों के खिलाफ दसियों अणुओं के हजारों की स्क्रीनिंग के लिए एक चुनौतीपूर्ण काम है; इस क्षेत्र में उच्च throughput स्क्रीन ध्यान से परिभाषित अभियान की आवश्यकता है. प्रमुख शेष चुनौतियों बल्कि तकनीक के लिए निहित समस्याओं से रसद और लागत के हैं. Heterologous स्क्रीनिंग व्यापक रूप से शैक्षणिक समूहों द्वारा ligands की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है, एक निजी कंपनी 100 मानव अन्य रैंकों 29 के लिए ligands की पहचान करने के लिए एक ही तकनीक का इस्तेमाल किया गया है. दुर्भाग्य से, इन आंकड़ों मालिकाना रहते हैं.
यहाँ रेखांकित उच्च throughput luciferase परख का आकलन या सक्रियण के लिए इस्तेमाल वैकल्पिक तरीकों पर कई फायदे हैं. हालांकि जिम्मेदारीदेशी घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के सत्र इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग मापा गया है, इन तकनीकों कठिनाई की वजह से घ्राण न्यूरॉन्स के लिए प्रतिक्रिया गुणों में ओवरलैप करने के लिए एक न्यूरॉन की प्रतिक्रिया की ओर जाता है जो या अलग चिढ़ा है. , एक GFP लेबल रिसेप्टर टाइप 30,31 में दस्तक 32,33 घ्राण न्यूरॉन्स murine को adenovirus के माध्यम से विशिष्ट रिसेप्टर्स पहुंचाने, या 17,24,33 एक रिसेप्टर प्रकार के लिए रिकॉर्डिंग लिंक कर सकते हैं रिकॉर्डिंग के बाद RT-पीसीआर प्रदर्शन, इन तरीकों यद्यपि कम throughput और बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए उपयुक्त नहीं. Heterologous स्क्रीनिंग सिस्टम अधिक स्केलेबल होते हैं, और दो प्रमुख रूपों साहित्य में पाए जाते हैं: शिविर मार्ग पत्रकारों और inositol triphosphate (IP3) मार्ग संवाददाताओं से. गंध उत्तेजना पर, अन्य रैंकों चक्रीय एएमपी (शिविर) 12 के उत्पादन में यह परिणाम है कि एक जी αolf पारगमन झरना संकेत को सक्रिय करें. एसी के नियंत्रण में एक जुगनू luciferase संवाददाता जीन सह transfecting द्वाराएएमपी प्रतिक्रिया तत्व (रचनात्मक), luciferase उत्पादन की मात्रा का ठहराव या सक्रियण के लिए अनुमति देता है, गंध प्रतिक्रिया के एक समारोह के रूप में मापा जा सकता है. या सक्रियण भी ऐसे जी α15/16 या एक जी α15-OLF कल्पना 24,25,34 के रूप में जी प्रोटीन सह व्यक्त की IP3 मार्ग से जोड़ा जा सकता है. हम तीन कारकों के आधार पर यहाँ प्रस्तुत परख चुना है: रो टैग घ्राण रिसेप्टर्स के साथ RTP1 (1) के सह अभिव्यक्ति कोशिका की सतह 19,27 पर घ्राण रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति में सुधार; (2) एक शिविर उत्तरदायी रिपोर्टर जीन के उपयोग की माप या विहित दूसरा दूत मार्ग के माध्यम से सक्रियण के लिए अनुमति देता है; और (3) परख उच्च throughput स्क्रीन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है.
इस उच्च throughput luciferase परख महक के क्षेत्र में बहुमूल्य अध्ययन की एक किस्म के लिए लागू है. सबसे पहले, अन्य रैंकों की एक बड़ी संख्या में एक सपा के लिए रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न निर्धारित करने के लिए एक एकल odorant के खिलाफ जांच की जा सकतीecific odorant. अध्ययन के इस प्रकार स्टेरॉयड odorant androstenone 8 का जवाब देने के लिए या जिम्मेदार के रूप में OR7D4 की पहचान की. इसके विपरीत, एक या रिसेप्टर प्रतिक्रिया प्रोफाइल 10 निर्धारित करने के क्रम में odorants के एक पैनल के खिलाफ जांच की जा सकती है. उम्मीदवार घ्राण odorant / या जोड़ों इन स्क्रीन के माध्यम से पहचाने जाते हैं, बातचीत odorant की बढ़ती सांद्रता के लिए या की प्रतिक्रिया की जांच एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग का आयोजन से इसकी पुष्टि की जा सकती है. खुराक प्रतिक्रिया घटता भी एक या में आनुवंशिक परिवर्तन विट्रो odorant प्रतिक्रिया 8,9,11,35 में कैसे प्रभावित करता आकलन कर सकते हैं, और इन अध्ययनों विकास में प्रजातियों और कारण म्यूटेशन भर रिसेप्टर विकास की परीक्षा के लिए अनुमति देता है, जैसा या परिवर्तन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है 36,37, अंत में, इस परख विरोध करने में सक्षम या एक ज्ञात odorant / रिसेप्टर जोड़ी 38,39 के लिए एक विशेष odorant के जवाब हैं कि गंध विरोधी लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्षेप में, यह उच्चथ्रूपुट luciferase परख विशेषताएँ मदद या सक्रियण पैटर्न और घ्राण प्रणाली में गंध कोडिंग की एक बेहतर समझ प्रदान करेगा कि अध्ययन की एक श्रृंखला के लिए लागू है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Odorant पहचान घ्राण रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न द्वारा इनकोडिंग है, लेकिन रिसेप्टर्स सक्रिय और क्या डिग्री करने के लिए कर रहे हैं जो सहित रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न, मानव घ्राण रिसेप्टर्स 1-11 के कम से कम 6% के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम R01 DC013339, R03 DC011373, और रूथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार T32 DC000014 द्वारा समर्थित किया गया. काम का एक हिस्सा एनआईएच NIDCD कोर अनुदान P30 DC011735 से धन के द्वारा, भाग में, समर्थित है जो Monell chemosensory रिसेप्टर संकेतन कोर, उपयोग किया गया था. लेखकों डेटा संग्रह के साथ मदद के लिए सी. Sezille धन्यवाद.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
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