Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität
Summary
Riechrezeptoraktivierungsmuster kodieren Geruch Identität, sondern der Mangel an veröffentlichten Daten zur Identifizierung Geruchsliganden für Säugetiergeruchsrezeptoren behindert die Entwicklung eines umfassenden Modells der Duftkodierung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Identifizierung Geruchsrezeptorliganden und Quantifizierung der Rezeptoraktivierung zu erleichtern.
Abstract
Geruchsstoffe schaffen einzigartige und überlappenden Mustern von olfaktorischen Rezeptoraktivierung, so dass eine Familie von rund 1.000 Mäuse-und 400 menschliche Rezeptoren, um Tausende von Geruchsstoffen zu erkennen. Riechstoffliganden für weniger als 6% der menschlichen Rezeptoren 1-11 erschienen. Dieser Mangel an Daten zum Teil auf Schwierigkeiten funktionell exprimieren diese Rezeptoren in heterologen Systemen. Hier beschreiben wir eine Methode für die Mehrheit der olfaktorischen Rezeptorfamilie in Hana3A Zellen, gefolgt von Hochdurchsatz-Beurteilung der olfaktorischen Rezeptoraktivierung mit Hilfe eines Luciferase-Reporter-Assay zum Ausdruck. Dieser Test kann (1) Bildschirm-Panels von Geruchsstoffen gegen Platten von olfaktorischen Rezeptoren verwendet werden; (2) bestätigen Geruchs / Rezeptor-Interaktion über Dosis-Wirkungs-Kurven; und (3) Vergleich der Rezeptoraktivierung Niveaus unter Rezeptorvarianten. In unserem Beispieldaten wurden 328 Geruchsrezeptoren gegen 26 Geruchsstoffe untersucht. Riechstoff / Rezeptor-Paare mit unterschiedlichen Antwort-Werte waren AuswahlTed und in Dosis-Wirkungs-getestet. Diese Daten zeigen, dass ein Bildschirm ist eine wirksame Methode, um Geruchs / Rezeptor-Paare, die eine Dosis-Wirkungs-Experiment passieren wird, dh Rezeptoren, die einen echten Reaktion auf einen Duftstoff haben zu bereichern. Daher ist dieses Hochdurch Luciferase-Assay eine effektive Methode zur Geruchsrezeptoren, einen wesentlichen Schritt in Richtung eines Modells der Duftkodierung im Säugetierriechsystem charakterisieren.
Introduction
Die Säugetierriechsystem hat die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Geruchsreize zu reagieren, so dass für den Nachweis und die Unterscheidung von Tausenden von Geruchsstoffen. Olfaktorischen Rezeptoren (OR) sind die molekularen Sensoren von den Riechzellen im Riechepithel 12 ausgedrückt. Säugetiergeruchserkennung erfolgt durch unterschiedliche Aktivierung von OR durch Geruchsstoffe, und die ODER-Gen-Familie ist umfangreich, mit rund 1.000 murinen und menschlichen Rezeptoren 400 12-16. Zurück funktionelle Analysen von OR in olfaktorischen Neuronen und in heterologen Zellen haben gezeigt, dass unterschiedliche Geruchsstoffe werden durch eindeutige erkannt, aber überlappenden Ensembles von OR 10,17-20. Passende Liganden an OPs ist entscheidend für das Verständnis der olfaktorischen Code und wesentlich für den Aufbau lebensfähige Modelle des Geruchssinns. Aufgrund von Schwierigkeiten exprimieren ORs in heterologen Systemen sowie die große Zahl der beiden Duftstoffe und ORs hat diese Daten von der f weitgehend gefehltield; ja, weniger als 6% der menschlichen OPs haben einen Liganden 1-11 veröffentlicht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Luciferase-Assays zur Geruchs / oder Wechselwirkungen charakterisieren. Dieser Test ermöglicht die Hochdurchsatz-Charakterisierung von OPs, eine Aufgabe, die für das Verständnis Geruchs / ODER Wechselwirkungen sowie die Entwicklung eines Modells der Duftkodierung ist.
Hochdurchsatz-Untersuchungen der OPs stehen vor drei großen Herausforderungen. Zunächst wurden ORs in heterologen Zellen exprimiert im ER zurückgehalten und anschließend in das Proteasom abgebaut 21,22, verhindert die RUP Interaktion mit Geruchsstoffen in dem Testsystem 23-25. Dieses Problem wurde durch die Entdeckung der Hilfsproteine, die stabile Zelloberflächenexpression von einer breiten Palette von OR 19,26,27 erleichtern gerichtet. Rezeptor-Transporter-Proteine 1 und 2 (RTP1 und 2) fördern oder Zelloberflächenexpression und Aktivierung in Reaktion auf Geruchsstimulation 19. Basierend auf dieser Arbeit wurden HEK293T-Zellenmodifiziert, um stabil exprimieren RTP1 lang (RTP1L) und RTP2, Rezeptor Expression verstärkenden Protein 1 und G αolf, was in der Hana3A Zellinie 19,27. Darüber hinaus ist die Art 3 muskarinischen Acetylcholinrezeptors (M3-R) wirkt mit ORs an der Zelloberfläche und fördert die Aktivierung in Reaktion auf Riechstoffe 26. Co-Transfektion eines OR mit RTP1S und M3-R in Hana3A Zellen führt die robuste, konsistente und funktionelle Expression von einer breiten Palette von OPs an der Zelloberfläche 27. Zweitens Säugetier ODER Repertoires sind recht groß. Bei Menschen, zum Beispiel, ist die OR-Repertoire um eine Größenordnung zahlreicher als die Geschmacksrezeptorrepertoire und 2 Größenordnungen zahlreicher als die visuellen Rezeptor Repertoire. Obwohl das Klonen einer einzigen OR ist eine relativ einfache Protokoll wird bedeutende Vorleistungen Aufwand erforderlich, um eine umfassende Bibliothek zu erzeugen. Drittens, obwohl wir wissen, dass in der Sicht, übersetzt Wellenlänge in Farbe undVorsingen in Frequenz übersetzt in Tonhöhe, die Organisation von Gerüchen schlecht verstanden, dass es schwierig für Forscher aus einer repräsentativen Stichprobe von Geruchsstoffen zu interpolieren. Obwohl einige Fortschritte an dieser Front 10,28 erzielt wurden, bleibt die Karte des olfaktorischen Landschaft unvollständig. Screening Zehntausende von Molekülen gegen Hunderte von OPs ist eine gewaltige Aufgabe; Hochdurchsatz-Bildschirme in diesem Bereich erfordern sorgfältig definierten Kampagnen. Die wichtigsten sind die verbleibenden Herausforderungen der Logistik und Kosten und nicht als Probleme, die auf die Technik. Obwohl heterologen Screening wurde nicht häufig verwendet, um Liganden von akademischen Gruppen zu identifizieren, hat ein privates Unternehmen die gleiche Technik verwendet, um Liganden für 100 menschlichen OR 29 zu identifizieren. Leider bleiben diese Daten geschützt.
Die Hochdurchsatz-Luciferase-Assay skizzierten hat mehrere Vorteile gegenüber verwendet werden, um zu beurteilen oder Aktivierung alternativer Methoden. Obwohl die Verantwortungses von nativen Riechzellen gemessen worden mit Elektrophysiologie und Kalzium-Imaging, haben diese Techniken Schwierigkeiten auseinander, die Hänseleien ODER Antwort eines Neurons aufgrund der Überlappung in Reaktion Eigenschaften für olfaktorischen Neuronen führt. Obwohl Klopfen in einem GFP-markierten Rezeptor Typ 30,31 und liefert spezifische Rezeptoren über Adenovirus olfaktorischen Neuronen murinen 32,33 oder die Durchführung der RT-PCR nach Aufnahmen 17,24,33 können Aufnahmen zu einzelnen Rezeptortypen zu verknüpfen, sind diese Methoden Niedrigdurchsatz und nicht für große Bildschirme geeignet. Heterologe Screening-Systeme sind skalierbar und zwei Hauptformen sind in der Literatur gefunden: cAMP-Weg Reportern und Inositol-Triphosphat (IP3)-Weg Reportern. Bei Geruchsstimulation, OPs aktivieren einen G αolf Übertragungssignalkaskade, die in der Produktion von zyklischem AMP (cAMP) 12 führt. Durch Co-Transfektion einer Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des NetzAMP-Response-Element (CRE), kann Luciferase-Produktion als Funktion der Geruchsreaktion gemessen werden, so dass für die Quantifizierung oder Aktivierung. Oder Aktivierung kann auch auf die IP3 Weges durch Coexpression G-Proteine, wie G α15/16 oder G α15-OLF-Chimäre 24,25,34 verbunden werden. Wir haben den Test hier dargestellt anhand von drei Faktoren ausgewählt: (1) die Co-Expression von RTP1 mit Rho-markierten Geruchsrezeptoren verbessert die Expression der olfaktorischen Rezeptoren an der Zelloberfläche 19,27; (2) Verwendung eines cAMP-responsive Reporter-Gen ermöglicht die Messung von OR-Aktivierung durch die kanonischen zweiten Messenger-Pfad; und (3) der Test ist gut geeignet, um Hochdurchsatz-Screens.
Dieser hohe Durchsatz Luciferase Assay auf eine Vielzahl von Studien wertvoll Bereich des Geruchssinns. Erstens kann eine große Anzahl von OR gegen einen einzelnen Geruchsstoff um die Rezeptoraktivierung Muster für ein sp bestimmen gescreent werdenecific Riechstoff. Diese Art der Studie identifizierten OR7D4 als OR für die Reaktion auf die Steroid-Geruchsstoff Androstenon 8 verantwortlich. Umgekehrt können eine oder können gegen eine Reihe von Geruchsstoffen, um die Rezeptorantwort Profil 10 zu bestimmen, untersucht werden. Wenn Kandidaten olfaktorische Geruchs / oder Paaren über diesen Fenstern identifiziert, kann die Interaktion durch die Durchführung einer Dosis-Wirkungs-Experiment der Prüfung der Antwort des ODER steigenden Konzentrationen von Geruchs bestätigt werden. Dosis-Wirkungs-Kurven können auch beurteilen, wie genetische Variation in einem oder in vitro Geruchs Antwort 8,9,11,35 beeinflusst, und diese Untersuchungen kann zu inter ODER Variante erweitert werden, so dass für die Prüfung der Rezeptor Evolution über Arten und kausale Mutationen in der Evolution 36,37 schließlich Dieser Assay kann verwendet werden, um Geruchs Antagonisten, die in der Lage, zu antagonisieren oder die Reaktion auf einen bestimmten Duftstoff für eine bekannte Geruchs / Rezeptor-Paar 38,39 sind zu screenen. Zusammenfassend, diese hohenDurch Luciferase-Assay ist für eine Reihe von Studien, die helfen, zu charakterisieren oder Aktivierungsmuster und ein besseres Verständnis der Duftkodierung im olfaktorischen System.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riechstoffidentität wird von Geruchsrezeptoraktivierungsmuster codiert, sondern Rezeptoraktivierungsmuster, einschließlich der Rezeptoren aktiviert werden und zu welchem Grad, für weniger als 6% der menschlichen Geruchsrezeptoren 1-11 bekannt. Anstrengungen zur Geruchsrezeptoren charakterisiert durch ihre arbeitsintensive Verfahren und Anwendbarkeit auf nur eine Teilmenge des olfaktorischen Rezeptorfamilie 17,23,24,33,34 beschränkt. Die Hana3A heterologe Expressionssystem unterstützt die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von DC013339 R01, R03 DC011373 und Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014 unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde mit dem Monell Chemosensorische Receptor Signaling Core unterstützt wird, die zum Teil durch Mittel aus dem NIH-NIDCD Kern Zuschuss P30 DC011735. Die Autoren danken C. Sezille für die Hilfe bei der Datenerhebung.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
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