Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité
Summary
Modèles d'activation des récepteurs olfactifs codent l'identité de l'odeur, mais le manque de données publiées identification des ligands odorants pour les récepteurs olfactifs de mammifères entrave le développement d'un modèle complet de codage de l'odeur. Ce protocole décrit un procédé pour faciliter l'identification à haut débit de ligands de récepteurs olfactifs et la quantification de l'activation du récepteur.
Abstract
Odorants créer des motifs uniques et se chevauchant de l'activation du récepteur olfactif, ce qui permet une famille d'environ 1000 et 400 murin récepteurs humains de reconnaître des milliers de substances odorantes. Ligands odorants ont été publiés pour moins de 6% des récepteurs humains 1-11. Ce manque de données est dû en partie à la difficulté à exprimer fonctionnellement ces récepteurs dans des systèmes hétérologues. Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer la majorité de la famille des récepteurs olfactifs dans des cellules Hana3A, suivi d'une évaluation à haut débit de l'activation du récepteur en utilisant un test olfactif rapporteur de la luciférase. Ce dosage peut être utilisé pour (1) des panneaux d'écran de substances odorantes contre les panneaux de récepteurs olfactifs; (2) confirmer interaction odorant / récepteur via des courbes dose-réponse; et (3) comparer les niveaux d'activation du récepteur entre les variants du récepteur. Dans nos données d'exemple, 328 récepteurs olfactifs ont été projetés contre 26 odorants. Paires odorant / récepteurs avec des scores variant de réponse étaient de sélectionted et testé en réponse à la dose. Ces données indiquent que l'écran est une méthode efficace pour enrichir en paires odorant / récepteurs qui vont passer d'une expérience de dose-réponse, à savoir les récepteurs qui ont une réponse de bonne foi à une substance odorante. Par conséquent, ce dosage de la luciférase à haut débit est une méthode efficace pour caractériser les récepteurs-une étape essentielle olfactif vers un modèle de codage d'odeur dans le système olfactif de mammifère.
Introduction
Le système olfactif de mammifère a la capacité de répondre à un grand nombre de stimuli odorants, permettant la détection et la discrimination des milliers de substances odorantes. Les récepteurs olfactifs (RUP) sont les capteurs moléculaires exprimés par les neurones sensoriels olfactifs dans l'épithélium olfactif 12. La reconnaissance de l'odeur de mammifère se produit par l'activation différentielle des RUP par odorants, et la famille ou le gène est vaste, avec environ 1000 murin et 400 récepteurs humains 12-16. Analyses fonctionnelles antérieures de RUP dans les neurones olfactifs et dans les cellules hétérologues ont montré que différentes substances odorantes sont reconnus par unique, mais qui se chevauchent ensembles de RUP 10,17-20. Ligands correspondants à RUP est essentiel pour comprendre le code olfactif et essentiel pour construire des modèles viables de l'olfaction. En raison de la difficulté à exprimer des RUP dans des systèmes hétérologues ainsi que le grand nombre des deux substances odorantes et les RUP, ces données ont été largement absent de la fIELD; en effet, moins de 6% des RUP humains ont un ligand publié 1-11. Ce protocole décrit l'utilisation d'un dosage de la luciférase pour caractériser les interactions odorantes / OU. Ce test permet la caractérisation à haut débit de RUP, une tâche qui est essentielle pour comprendre odorant / OU interactions ainsi que l'élaboration d'un modèle de codage des odeurs.
Études à haut débit de RUP sont confrontées à trois défis majeurs. Tout d'abord, RUP exprimés dans des cellules hétérologues ont été retenues dans le RE et ensuite dégradées dans le protéasome 21,22, ce qui empêche les RUP d'interagir avec des substances odorantes dans le système de dosage de 23 à 25. Ce problème a été résolu par la découverte de protéines accessoires qui facilitent l'expression stable à la surface cellulaire d'un large éventail de RUP 19,26,27. Récepteur-transporteur protéines 1 et 2 (RTP1 et 2) promouvoir ou expression à la surface cellulaire et l'activation en réponse à la stimulation odorante 19. Sur la base de ce travail, les cellules étaient HEK293Tmodifiée pour exprimer de manière stable à long RTP1 (RTP1L) et RTP2, améliorant l'expression du récepteur de protéine 1, et G αolf, résultant dans la lignée cellulaire Hana3A 19,27. En outre, le récepteur de l'acétylcholine muscarinique de type 3 (M3-R) interagit avec RUP à la surface des cellules et augmente en réponse à l'activation 26 des agents odorants. La co-transfection d'un OU avec RTP1S et M3-R en Hana3A cellules résulte de l'expression robuste, cohérente et fonctionnelle d'un large éventail de RUP à la surface de la cellule 27. Deuxièmement, mammifères ou répertoires sont assez grandes. Chez les êtres humains, par exemple, le répertoire OR est un ordre de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs gustatifs, et deux ordres de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs visuelle. Bien que le clonage d'un simple OU est un protocole relativement simple, important effort initial est nécessaire pour générer une bibliothèque complète. Troisièmement, même si nous savons que dans la vision, la longueur d'onde se traduit par la couleur etla fréquence de l'audition se traduit pas, l'organisation des odeurs est mal comprise, ce qui rend difficile pour les chercheurs d'interpoler à partir d'un échantillon représentatif de substances odorantes. Bien que certains progrès ont été réalisés sur ce front 10,28, la carte du paysage olfactif reste incomplète. Dépistage des dizaines de milliers de molécules contre des centaines de RUP est une tâche ardue; criblages à haut débit dans ce domaine nécessitent des campagnes soigneusement définis. Les principaux défis à relever sont ceux de la logistique et des coûts plutôt que sur les problèmes inhérents à la technique. Bien que le dépistage hétérologue n'a pas été largement utilisé pour identifier des ligands par des groupes universitaires, une société privée a utilisé la même technique pour identifier des ligands pour 100 RUP humaines 29. Malheureusement, ces données restent propriétaires.
Le dosage de la luciférase à haut débit décrit ici présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives utilisées pour évaluer ou d'activation. Bien que la responsabilitésession de neurones sensoriels olfactifs indigènes ont été mesurées à l'aide d'électrophysiologie et d'imagerie calcique, ces techniques ont des difficultés à taquiner à part qui OU conduit à la réponse d'un neurone en raison du chevauchement dans les propriétés de réponse des neurones olfactifs. Bien que dans un cognement-GFP-étiqueté du récepteur de type 30,31, délivrant par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques de l'adénovirus murins neurones olfactifs 32,33, ou d'effectuer une RT-PCR après enregistrements 17,24,33 peuvent lier des enregistrements de types de récepteurs individuels, ces méthodes sont faible débit et ne convient pas pour les écrans de grande envergure. Systèmes de contrôle hétérologues sont plus évolutive, et deux formes principales se trouvent dans la littérature: les journalistes de la voie de l'AMPc et l'inositol triphosphate (IP3) journalistes de la voie. Lors de la stimulation de l'odeur, RUP activent une cascade de signalisation αolf G de transduction qui conduit à la production d'AMP cyclique (AMPc) 12. Par co-transfection d'un gène rapporteur de luciférase de luciole sous le contrôle d'acÉlément de réponse à l'AMP (CRE), la production de la luciférase peut être mesurée en fonction de la réponse de l'odeur, ce qui permet la quantification de l'activation OU. Ou l'activation peut également être lié à la voie IP3 par la co-expression des protéines G telles que G α15/16 ou un G α15-olf chimère 24,25,34. Nous avons choisi le test présenté ici repose sur trois facteurs: (1) la co-expression de RTP1 avec récepteurs olfactifs Rho-marqués améliore l'expression des récepteurs olfactifs à la surface des cellules 19,27; (2) l'utilisation d'un gène rapporteur AMPc-sensible permet la mesure de OU activation par la voie de second messager canonique; et (3) le test est bien adaptée aux écrans à haut débit.
Ce dosage de la luciférase à haut débit est applicable à une variété d'études de grande valeur dans le domaine de l'olfaction. Premièrement, un grand nombre de RUP peut être criblée contre une seule substance odorante en vue de déterminer le motif de l'activation du récepteur pendant une spodorant ecific. Ce type d'étude a identifié OR7D4 comme le OU chargé de répondre à l'androsténone odorant stéroïde 8. Inversement, un ou peut être projeté contre un panneau de substances odorantes afin de déterminer le profil de la réponse du récepteur 10. Lorsque candidat olfactif odorant / OU paires sont identifiés par ces écrans, l'interaction peut être confirmé par la réalisation d'une expérience de dose-réponse examiner la réponse de la salle d'opération à des concentrations croissantes de substance odorante. courbes dose-réponse peuvent également évaluer la variation génétique dans une OU affecte en réponse odorant vitro 8,9,11,35, et ces études peuvent être étendues à interspécifique OU variation, permettant à l'examen de l'évolution des récepteurs à travers les espèces et les mutations causales dans l'évolution 36,37, Enfin, ce dosage peut être utilisé pour cribler des antagonistes d'odeurs qui sont capables d'antagoniser ou une réponse à une substance odorante particulier pour une paire odorant / récepteur connue 38,39. En résumé, cette hauteDosage de la luciférase-débit est applicable à une série d'études qui aideront à caractériser ou des motifs d'activation et de fournir une meilleure compréhension du codage des odeurs dans le système olfactif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identité odorant est codé par des motifs d'activation des récepteurs olfactifs, mais les modèles d'activation des récepteurs, y compris les récepteurs qui sont activées et à quel degré, sont connus pour moins de 6% des récepteurs olfactifs humains 1-11. Les efforts visant à caractériser les récepteurs olfactifs ont été limités par leurs méthodes ou de l'applicabilité de main-d'œuvre à un sous-ensemble de la 17,23,24,33,34 de famille de récepteur olfactif. Le sys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par R01 DC013339, R03 DC011373, et Ruth L. Kirschstein Service national de la recherche Prix T32 DC000014. Une partie des travaux a été réalisée en utilisant le Monell Chemosensory signalisation des récepteurs de base, qui est pris en charge, en partie, par le financement de la P30 DC011735 NIH-NIDCD base Grant. Les auteurs remercient C. Sézille de l'aide à la collecte de données.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
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