루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석
Summary
후각 수용체 활성화 패턴 악취 ID를 인코딩하지만, 포유 동물의 후각 수용체 리간드 취제를 식별 발행 데이터의 부족은 악취 코딩의 광범위한 정보 모델의 개발을 방해한다. 이 프로토콜은 후각 수용체 리간드 및 수용체 활성화의 정량 높은 처리량의 식별을 용이하게하는 방법을 설명한다.
Abstract
취기 약 1,000 쥐 400 인간의 수용체의 가족이 냄새 물질의 수천을 인식 할 수 있도록, 후각 수용체 활성화의 독특하고 중복 패턴을 만들 수 있습니다. 악취 물질 리간드는 인간의 수용체 1-11 미만 6 %에 발표되었다. 데이터의 부족은 일부 기능 이종 시스템에서이 수용체를 발현하는 어려움 때문이다. 여기서, 우리는 루시퍼 라제 리포터 분석을 이용하여 후각 수용체 활성화의 높은 처리량 평가 하였다 Hana3A 세포 후각 수용체 패밀리의 대부분을 표현하기위한 방법을 설명한다. 이 분석은 후각 수용체의 패널에 대하여 취기 (1)의 화면 패널에 사용될 수있다; (2) 용량 반응 곡선을 통해 취제 / 수용체 상호 작용을 확인; (3) 수용체 변이체 구비 수용체 활성화 수준을 비교한다. 우리의 샘플 데이터에서 328 후각 수용체 (26)의 냄새 물질에 상영되었다. 다양한 응답 점수 후각 / 수용체 쌍 SELEC했다테드 및 용량 반응 시험. 이 데이터는 화면이, 악취 물질에 대한 선의의 진실 반응이, 즉 수용체를 용량 반응 실험을 통과 할 후각 / 수용체 쌍에 대해 풍부하게 할 수있는 효과적인 방법임을 나타냅니다. 따라서, 이러한 높은 처리량 루시페라아제 분석법은 포유 동물의 후각 시스템 악취 코딩 모델 향해 후각 수용체-필수적인 단계를 특성화하는 효과적인 방법이다.
Introduction
포유 동물의 후각 시스템은 탐지 및 취기 수천 차별을 허용 악취 자극의 광대 한 수에 응답 할 수있는 능력을 갖는다. 후각 (논리합)는 후각 상피 (12)에서 후각 감각 뉴런에 의해 표현 분자 센서이다. 포유 동물의 냄새를 인식 취기에 의한 관찰 보고서의 차등 활성화를 통해 발생하고 또는 유전자 가족은 대략 1,000 쥐 400 인간의 수용체 12-16으로 광범위하다. 후각 신경 세포 및 이종 세포에서 관찰 보고서의 이전 기능 분석은 다른 냄새 물질은 고유 한 인식하는 것으로 나타났습니다하지만, 관찰 보고서 10,17-20의 앙상블을 겹쳐있다. 관찰 보고서에 리간드를 매칭 후각 코드와 후각의 실행 가능한 모델을 구축하기위한 핵심을 이해하는 것이 중요합니다. 인해 취기 및 논리합 모두의 다수뿐만 아니라 이종 시스템에서 논리합을 표현하는 어려움이 데이터는 F에서 큰폭 결석왔다ield; 참으로, 인간의 관찰 보고서 미만 6 % 게시 된 리간드 1-11있다. 이 프로토콜은 취제 / OR 상호 작용을 특성화하는 루시페라아제 분석의 사용을 설명한다. 이 분석은 논리합의 높은 처리량 특성화 취제 / OR 상호 작용을 이해뿐만 아니라 악취 코딩 모델을 개발에 필수적인 작업을 가능하게한다.
관찰 보고서의 높은 처리량 연구는 세 가지 주요 과제에 직면하고 있습니다. 첫째, 이종 세포에서 발현 관찰 보고서는 ER에 유지하고, 이후 분석 시스템 23-25에서 냄새 물질과 상호 작용에서 관찰 보고서 방지, 프로 테아 솜 (21, 22)에서 분해. 이 문제는 논리합 19,26,27 광범위한 안정된 세포 표면 발현을 촉진 소품 단백질의 발견에 의해 해결되었다. 수용체 – 수송 – 단백질 1과 2 (RTP1 2) 쇼핑 후각 자극 (19)에 대한 응답으로 세포 표면 발현 및 활성화. 본 작업에 기초하여, HEK293T 세포되었습니다안정적으로 Hana3A 세포주 19,27 결과 RTP1 긴 (RTP1L) 및 RTP2, 수용체 발현을 향상시키는 단백질 1, 및 G의 αolf을 표현하기 위해 수정. 또, 분류 3 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체 (M3-R)는 세포 표면에서 관찰 보고서와 상호 작용 및 취기 제 (26)에 응답하여 활성화를 향상시킨다. 세포 표면 27에서 관찰 보고서의 넓은 범위의 강력한 일관성 및 기능 식 Hana3A 세포 결과에 RTP1S와 M3-R와 OR의 공동 형질. 둘째, 포유 동물 또는 레퍼토리는 매우 크다. 인간에서는, 예를 들면, OR 레퍼토리는 미각 수용체 레퍼토리보다 다양한 크기의 순서이며, 시각 수용체 레퍼토리보다 다양한 크기의이 순서. 하나의 복제 또는 것은 비교적 간단한 프로토콜이지만, 중요한 선행 노력이 포괄적 인 라이브러리를 생성하기 위해 필요합니다. 우리는 비전을 알고 있지만, 셋째, 파장은 색상으로 변환하고오디션 주파수 피치로 변환에, 냄새의 조직은 가난 어려운 연구자의 냄새 물질의 대표 샘플에서 보간하기 위해 만드는 이해된다. 일부 진전이 전면 10,28에 만들어진 있지만, 후각 풍경의지도가 불완전 남아있다. 관찰 보고서의 수백에 수십 분자의 수천을 상영하는 것은 어려운 작업입니다; 이 도메인의 높은 처리량 화면을주의 깊게 정의 캠페인을 필요로한다. 주요 남은 문제는 오히려 기술에 내재 된 문제보다 물류 비용의 사람입니다. 이종 스크리닝 폭넓게 학술기로 리간드를 식별하는 데 사용되지 않았지만, 개인 회사 100 인간 논리합 29 대한 리간드를 식별하는 동일한 기술을 사용하고있다. 불행하게도, 이러한 데이터 독점 남아있다.
여기에 설명 높은 처리량 루시 페라 제 분석은 평가 또는 활성화하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 비록 respon기본 후각 감각 뉴런의 SES는 전기 생리학과 칼슘 이미징을 사용하여 측정 된이 기술은 어려움으로 인해 후각 신경 세포에 대한 응답 특성의 중첩에 신경 세포의 반응에 이르게 또는 떨어져 괴롭 히고있다. , GFP – 라벨 수용체 타입 (30, 31)에서 노킹 (32, 33) 후각 신경 세포를 생쥐에 아데노 바이러스를 통해 특정 수용체를 제공, 또는 17,24,33 단일 수용체의 종류에 녹음을 링크 할 수 있습니다 녹음 한 후 RT-PCR을 수행,이 방법은 있지만 낮은 처리량과 대형 화면에 적합하지 않습니다. 이종 검사 시스템은 확장 성, 그리고 두 가지 주요 형태는 문헌에서 찾을 수 있습니다 : 캠프 통로 기자 이노시톨 인산염 (IP3) 통로 기자. 냄새 자극에, 관찰 보고서는 고리 AMP (캠프) 12의 생산 결과 G의 αolf 전달 신호 폭포를 활성화합니다. AC의 제어 하에서 반딧불 루시퍼 라제 리포터 유전자를 공동 형질 작성자AMP 반응 요소 (CRE), 루시퍼 라제 생산 부량 OR 활성화를 허용 악취 응답의 함수로서 측정 될 수있다. 또는 활성화 또한 G α15/16 또는 G의 α15-OLF 키메라 24,25,34 등의 G-단백질을 공동으로 표현하여 IP3 경로에 연결할 수 있습니다. 우리는 세 가지 요인에 따라 여기에 제시된 분석을 선택했습니다 : RHO-태그 후각 수용체와 RTP1 (1) 공동 발현 세포 표면 19,27의 후각 수용체의 발현을 향상을; (2) 캠프 응답 리포터 유전자의 사용은 측정 또는 정규 두 번째 메신저 경로를 통해 활성화 할 수 있습니다; (3) 분석은 높은 처리량 스크린에 매우 적합하다.
이것은 높은 처리량 루시퍼 라제 분석은 후각의 분야에 유용한 다양한 연구에 적용 할 수있다. 우선, 관찰 보고서의 다수의 SP에 대한 수용체 활성화 패턴을 결정하기 위해 단일 취제에 대해 스크리닝 할 수있다ecific 악취 물질. 이런 종류의 연구는 스테로이드 악취 물질 androstenone 8에 응답 또는 책임으로 OR7D4을 확인했다. 반대로, 하나의 OR은 수용체 응답 프로파일 (10)을 결정하기 위해 방향제의 패널에 대해 스크리닝 할 수있다. 후보 후각의 취제 / OR 쌍이 이러한 화면을 통해 확인 될 때, 상호 작용의 증가 취제 농도 OR의 응답을 검사하는 투여 량 반응 실험을 수행함으로써 확인 될 수있다. 용량 반응 곡선은 OR에있는 유전 변이가 체외 후각 응답 8,9,11,35에 미치는 영향을 평가할 수 있으며, 이러한 연구는 진화의 종류 및 원인 돌연변이를 통해 수용체 진화의 시험을 허용, 종간 또는 변화에 확장 될 수있다 36, 37는, 마지막으로,이 분석은 길항 할 수 또는 알려진 후각 / 수용체 쌍 (38, 39)에 대한 특정 악취 물질에 대한 응답이다 냄새 길항제에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 요약하면, 이러한 높은처리량 루시페라아제 분석법 특성화 OR 활성화 패턴 및 후각 시스템에서 악취 코딩의 더 나은 이해를 제공 할 것이다 연구의 범위에 적용 가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
악취 물질 ID는 후각 수용체 활성화 패턴에 의해 인코딩되어 있지만 수용체가 활성화되고 어느 정도에하는 등의 수용체 활성화 패턴은, 인간의 후각 수용체 1-11 미만 6 % 알려져있다. 후각 수용체를 특성화하기위한 노력이 후각 수용체 가족 17,23,24,33,34의 서브 세트 만에 자신의 노동 집약적 인 방법이나 적용에 의해 제한되었다. Hana3A 이종 발현 시스템은 시험 후각 수용체의 대부분…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 R01 DC013339, R03 DC011373, 루스 L. 키르 국가 연구 서비스 상 T32 DC000014에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 NIH-NIDCD 코어 부여 P30의 DC011735 자금에 의해 부분적으로 지원되는 모넬 화학 감각 수용체 신호 코어를 사용하여 수행 하였다. 저자는 데이터 수집에 대한 도움 C. Sezille 감사합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
