Abstract
Существенный прогресс был достигнут в определении механизма митохондриальной редактирования РНК в трипаносом. Точно так же, значительный прогресс был достигнут в выявлении компоненты editosome комплекса, которые катализируют редактирование РНК. Тем не менее, он по-прежнему не ясно, как эти белки работают вместе. Химические соединения, полученные с экрана высокой пропускной против editosome может блокировать или повлиять на один или более этапов в цикле редактирования. Таким образом, выявление новых химических соединений будет генерировать ценные молекулярные зонды для рассечения функцию editosome и сборку. В предыдущих исследованиях, в пробирке редактирования анализы проводились с использованием радиоактивно меченного РНК. Эти анализы требуют много времени, неэффективны и не подходят для целей высокой пропускной. Здесь, однородная флуоресценции основе "смешивать и измерения" молот рибозим в пробирке репортер анализа для мониторинга редактирование РНК, представлена. Только как следствие редактирования РНКмолот рибозим флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) олигорибонуклеотид субстрат подвергают расщеплению. Это в свою очередь приводит к разделению флуорофора от гасителя с получением таким образом сигнал. В противоположность этому, когда функция editosome ингибируется, сигнал флуоресценции будет гасили. Это очень чувствительный и простой анализ, который должны широко применяться для мониторинга в пробирке редактирования РНК или высокопроизводительного скрининга химических веществ, которые могут препятствовать функцию editosome.
Introduction
Процесс редактирования РНК, пост-транскрипционного модификации мРНК, был впервые обнаружен в trypanosomatids 1. С тех пор, значительная работа была проведена в изучении механизма за редактирование РНК в Trypanosoma brucei 2,3. В серии ферментативных реакций, editosome, основной комплекс около 20 белков, создает зрелых митохондриальных мРНК для нескольких компонентов генерирующего энергию окислительного фосфорилирования системы. Порядок каталитических событий эндонуклеолитического декольте, uridylate (U) добавление или удаление, и перевязки, как это диктуется направляющих РНК (gRNAs) 4.
В дополнение к основным editosome сложных белков, ряд дополнительных факторов были также определены 5-7. Эти белки в основном видели сгруппированы в независимых комплексов. Тем не менее, порядок сборки белка в editosome комплекса основного и шаблоны взаимодействия основного комплекса с аксессуаркомплексы еще предстоит определить. Ориентация на процесс редактирования РНК в trypanosomatids может обеспечить химические Диссекторы, которые помогают в изучении сборку и функцию editosome комплекса. Кроме того, функциональные исследования на нескольких editosome белков показали существенности через разных этапах жизни, что свидетельствует об их потенциал как препарат нацелен 8-12. Таким образом, найдено ингибиторы editosome может также действовать в качестве ведущих соединений против trypanosomatids. Это своевременно, как имеющиеся в настоящее время препараты против заболеваний, вызванных trypanosomatid являются токсичными, неэффективной и дорогой 13,14.
Эффективным и удобным для анализа в пробирке необходимо исследовать химический вселенную для специфических ингибиторов, которые блокируют редактирование РНК. Три анализы были разработаны и используются для мониторинга editosome деятельности: (а) полный раунд в пробирке редактирования РНК анализа 15, (б) предварительно расщепляется в пробирке редактирования РНК анализа 16,17,й (с) молот рибозим (HHR) на основе анализа 18. Первые два анализы полагаться на прямой визуализации редактируемого продукта (АТФазы 6 мРНК) с помощью радиоактивности. HHR основе анализа использует модифицированную версию АТФазы 6 мРНК, что моделируется вести себя как рибозим при редактировании. Функциональная Рибозим затем специально расщепляет радиоактивной РНК субстрат, выступающей в качестве репортера. Недавно Moshiri соавт. Разработали 'смешивать и измерять' HHR основе в пробирке анализе репортерного контролировать редактирование РНК, где радиоактивно помеченных РНК-подложка заменяется переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET) подложки 19. Основными преимуществами данного анализа являются: (а) это быстрый и удобный смеси и мера тип анализа, как производство активного рибозима и подложки расщепления происходят одновременно в той же пробирке в малом объеме (т.е. 20 мкл), (б ) это позволяет избежать использования радиоактивно меченых материалов, (в) чувствительность то естьfforded с помощью флуоресцентной приборов в формате микро-титра пластины, и (г) высокое отношение сигнал-шум. С помощью этого анализа, эффект известными редактирование РНК лигазы ингибиторов против очищенного editosome было подтверждено 19. Этот эксперимент подтвердил правильность анализа для быстрой идентификации ингибиторов редактирования РНК, в первую очередь против целых editosomes от Т. brucei.
Рисунок 1 представляет собой подробное шаг за шагом схема флуоресценция основе в пробирке редактирования РНК анализа. Этот протокол может быть использован для мониторинга редактирование РНК в пробирке или быть легко адаптирована для скрининга библиотек соединений различных масштабов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол ниже описана процедура для выполнения флуоресценции на основе РНК-редактирования анализа. Анализ может быть выполнен в одной пробирке ПЦР, 96-луночный, или 384-луночных планшетах в зависимости от объема эксперимента. Впоследствии сигнал флуоресценции можно прочитать на соответствующей ПЦР в реальном времени системы обнаружения. Анализ описано здесь в контексте 384-луночных планшетах.
1. Культивирование Т. brucei Клетки
- Подготовьте питательную среду для Т. brucei проциклической формы клеток. Для 1 л среды:
- Растворите 25,4 г СДМ-79 порошок в 800 мл miliQ воды.
- Добавить 2 г NaHCO 3 и рН до 7,3 с помощью 10 М NaOH.
- Добавить NanoPure воду до конечного объема 900 мл, фильтр стерилизуют.
- Добавить фетальной бычьей сывороткой (FBS), пенициллин-стрептомицина и раствор Hemin (2,5 мг / мл) до конечных концентраций 10% (об / об), 100 Ед / мл и 7,5 мг / л соответственно.
- Вырастить 300 мл Т. <EM> brucei 1.7A дикого типа (проциклической форма) клеток при 28 ° С, тряску при 70 оборотах в минуту до плотности 1,5 х 10 7 клеток / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно произвести 3 мл активного editosome с ~ 0,5 мг общего белка, достаточное для 600 реакций редактирования.
- Сбора клеток путем центрифугирования при 6000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Промыть гранулу с 50 мл охлажденного буфера ПБСГ (10 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ NaH 2 PO 4, 145 мМ NaCl и 6 мМ глюкозы) и спин вниз клетки снова центрифугированием при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
2. Выделение Crude Митохондрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены на льду или при температуре 4 ° С, чтобы сохранить editosome деятельность.
- Ресуспендируют собранных клеток в 30 мл DTE буфере (1 мМ Трис-HCl, рН 8,0 и 1 мМ ЭДТА). Используйте 40 мл стерильной Dounce гомогенизатора (предварительно охлажденной), чтобы сорвать клеточную мембрану поглаживая вверх и вниз, по крайней мере 10 раз на льду. Сразу же добавить 4,3 мл 60% сахарозы (в / о, т. е. 1,75 M) в гомогенате до конечной концентрации 0,25 М. центрифуге при 15800 х г в течение 10 мин при 4 ° С, предпочтительно, чтобы сбить митохондрии.
- Ресуспендируют осадок митохондрий в 4,6 мл STM буфера (20 мМ Трис-HCl рН 8,0, 250 мМ сахарозы и 2 мМ MgCl 2). Добавить 13,8 мкл 0,1 М CaCl 2 и 4 мкл РНКазы ДНКазы I до конечных концентраций 0,3 мМ и 9 ед / мл, соответственно. Выдержите смесь в течение 1 часа на льду.
- Добавить 4,6 мл STE буфера (20 мМ Трис-HCl рН 8,0, 250 мМ сахарозы и 2 мМ EDTA) для инактивации ДНКазы I. центрифуге при 15800 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют гранул в 400 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис-HCl рН 7,2, 10 мМ MgCl 2, 100 мМ KCl, 1 мкг / мл пепстатина, 1 мМ DTT, и 1x полное ЭДТА без ингибитора протеазы) и переход к пробирке.
- Добавить 10% Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% вй инкубировать лизата в течение 15 мин при 4 ° С на трубе ротатора.
- Очистка митохондриальной лизата центрифугированием дважды в 17000 х г в течение 15 мин при 4 ° С; сохраняя очищенной супернатант каждый раз.
3. Editosome Очистка
- Налейте 10 мл 10% -30% (объем / объем) линейный градиент глицерин (табл. 1) в ультрацентрифужную пробирку с помощью 2x HHE градиента буфера (40 мМ HEPES рН 7,9, 20 мМ Mg (OAc) 2, 100 мМ KCl, и 2 мМ ЭДТА) и градиент производитель, следуя инструкции по эксплуатации.
- Осторожно удалить 500 мкл раствора из верхней части глицеринового градиента и осторожно загрузить 500 мкл очищенной митохондриальной лизата. Вращение на 178 000 х г в течение 6 ч при 4 ° С с использованием ультрацентрифуги.
- Сбор 500 мкл фракции последовательно от верхней к нижней части градиента при 4 ° С. Тогда оснастки заморозить фракций не используя жидкий азот и хранят при -80 ° С до использования.
- Отжиг соответствующий шаблон ДНК, содержащую последовательность, комплементарную последовательности промотора Т7 (таблица 2) с промотором Т7 олигонуклеотида (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') в молярном соотношении 1:1 при нагревании при 90 ° С в течение 3 мин и охлаждения при комнатной температуре по крайней мере, 10 мин.
- Расшифруйте РНК с использованием набора в пробирке транскрипции, следуя инструкции по эксплуатации.
- Остановить реакцию транскрипции, добавив равный объем 7 М мочевины красителя (7 М мочевины, 0,05% Ксилол Cynol, и 0,05% Бромфенол синий). Запустите на фильтре стерилизованного 9% денатурирующих полиакриламидном геле (9% акриламида, 7 М мочевину, 1x КЭ).
- Используйте ультрафиолетового (УФ) слежку с коротковолновой ультрафиолетовой лампой, чтобы найти и акцизного соответствующей РНК. Поместите гель вырезали кусок в пробирке и добавить 400 мкл буфера для элюции гель (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 250 мМ NaOAc, 1 мМ ЭДТА и 0,25% SDS). Элюции ночи при комнатной температуре на трубке ротатора.
- Precipitate элюированного РНК путем добавления 1 мл холодного 100% этанола и инкубировали либо при -80 ° С в течение 30 мин или от -20 ° C в течение ночи.
- Центрифуга при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С, для осаждения вниз РНК.
- Вымойте гранул с 1 мл 75% этанола. Центрифуга при 16000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют осадок РНК надлежащим образом в РНКазы свободной воды, чтобы достичь желаемых концентраций, как показано в таблице 2.
Флуоресценции основе анализа 5. РНК Редактирование
- Для одного реакции, смешайте 1 пмоль (1 мкл) preA6Rbz и 2,5 пмоль (1 мкл) gA6Rbz (1:2,5 молярное отношение) в пробирке, инкубировать при 70 ° С в течение 3 мин и оставьте при комнатной температуре в течение по крайней не менее 10 мин.
- Между тем приготовить основной смеси, используя таблицу 3, без preA6Rbz и gA6Rbz, для реакции редактирования, содержащего 1x HHE буфера (25 мМ HEPES рН 7,9, 10 мМ Mg (OAc) 2, 50 мМ KCl и 10 мМ ЭДТА), 1 мМАТФ, 5 мМ CaCl 2, 16 нг / мкл дрожжевой РНК Torula, 0,1% Тритон Х-100, и очищенный editosome.
- Добавить отожженная preA6Rbz и gA6Rbz для завершения основной смеси.
- Внесите 18 мкл мастер-микса (табл. 3) в лунки, содержащие либо 2 мкл РНКазы свободной воды (скважина без каких-либо соединений) или 2 мкл 200 мкМ химических соединений и включают контрольные образцы в пластине в соответствии с рисунком 5.
- Уплотнение тарелку с заклеивания планшетов и спин тарелку, чтобы удалить пузырьки воздуха. Инкубировать при 28 ° С в течение 4 часов.
- Добавить 25 пмоль (2 мкл) gA6Rbz конкурента в каждую лунку. Наведите свежий герметик, спина тарелку и положите его на ПЦР в реальном времени машины. Программирование следующий эксперимент:
Шаг 1: 85 ° C в течение 5 мин; Шаг 2: 24 ° C в течение 10 мин; Шаг 3: Стоп. - Добавить 15 пмоль (1 мкл) FRET субстрата в каждую лунку в конечном объеме 23 мкл. Уплотнение тарелку со свежим герметиком.Быстро вращать тарелку и поместить его обратно на ПЦР в реальном времени машины.
- Программирование новый эксперимент, выполнив следующие действия:
Шаг 1: 37 ° C в течение 1 мин; Шаг 2: Ознакомьтесь; Шаг 3: Перейдите к этапу 1, 40 раз; Шаг 4: Стоп. - Настройка тарелку, выбрав все колодцы, которые требуют чтения и выбрать FAM фильтр. Объем Входной как 23 мкл и начать работать.
- Рассчитать наклон значений, полученных из каждой лунки / образец для получения кинетической измерения путем построения склоны в виде столбика для анализа. ПРИМЕЧАНИЕ: кинетическая чтения улучшает отношение сигнал-шум между образцом и на заднем плане; как фон образец будет иметь наклон, близкий к нулю. Точка чтения конец имеет более высокий фоновый шум.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать необходимые шаги, необходимые для создания экрана масштабную, рис 2-5 представлены типичные контрольные эксперименты, связанные с качеством анализа. Это необходимые контрольные эксперименты для последовательного анализа в течение нескольких дней скрининга или для сравнения различных экранов.
Оценивая побед флуоресценции сигнал-шум
Для обеспечения стабильности и качества меченого флуоресцеином олигорибонуклеотид подложки в установке крупномасштабного, Z 'фактор, определяется как разница между анализа фона и максимального сигнала была рассчитана с использованием активную молекулу рибозима (A6Rbz). . Анализы с Z 'фактора> 0,5 считаются приемлемыми для экрана высокой пропускной Рисунок 2 показывает репрезентативные данные с использованием FRET субстрат, меченный флуоресцеином 5' (FAM; эмиттер) и 3'-N, N '-тетраметилthylrhodamine (TAMRA; жажду) (A6Rbz_F / Т). Этот субстрат произвел Z 'фактор 0,64, когда вычисляется с использованием 72 повторов в присутствии и в отсутствие A6Rbz.
В этом анализе альтернативный субстрат с помощью Айова черный темно гаситель (A6Rbz_F/Ib) может дать лучшее отношение сигнал-шум по сравнению с TAMRA. Это потому, что Айова Черный, в отличие от TAMRA, излучает поглощенную энергию в виде тепла и не свет. Z 'фактор получены с использованием FAM / Айова черный (F / Ib)-меченого субстрата был 0,68. Улучшение Z 'фактора для F / Ib-меченого субстрата над TAMRA-меченого субстрата из-за его относительно низкой фоне. Эти представительные результаты показывают, что обе подложки жизнеспособные варианты для использования в экране высокой пропускной.
Определение Редактирование деятельности глицерина фракциях градиента
Чтобы определить, и выберите наиболее активных editosome фракций для экспериментов, в глицерол градиент фракции тестировали для редактирования в пробирке с помощью флуоресценции на основе анализа (Шаг V). Эти данные показывают, (рис. 3) фракции 7-12 в качестве наиболее активных фракций (≥ 50% редакция деятельности; с наиболее активной фракции за 100%). Эти фракции могут быть объединены, когда требуется более editosome.
Расчет Z 'фактор, когда Editosome фракции объединяют
Для определения влияния на combinig editosome фракцию, значение Z 'фактор 0,6 рассчитывали, когда наиболее активные фракции (F8 + F9 + F10) были использованы в качестве источника editosome. Для вычисления коэффициента Z '72 повторов были испытаны в присутствии и в отсутствие editosome (рис. 4). F / Ib субстрата использовали в этом эксперименте. Эти данные показывают, что на основе Z 'фактора, сочетающий глицерина градиент фракций иметь минимальный эффект на качество анализа.
задницу = "jove_content"> Эксперимент представитель управления для анализа
Представительства данные, сравнивающие различные контрольные образцы были использованы для анализа переменные в анализе. Как показано на рисунке 5, реакции недостающие любые компоненты редактирования РНК (реакции 1-4) не расщепляют субстрат. Расщепление субстрата если судить по флуоресценции и относительной редактирования деятельности наблюдается только в присутствии всех компонентов реакций редактирования в отсутствие ингибитора (реакция 5) или в присутствии всех компонентов редактирования и неактивной соединения (реакция 6). В противоположность этому, ингибирующее соединение может блокировать редактирование РНК и используется в качестве положительного контроля (реакция 7). Здесь Mordant черный (MrB) и соединения C53 были использованы в качестве положительных и отрицательных контролей, соответственно.
ghres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1. Hammerhead рибозим основе в пробирке редактирования РНК анализа. А) Шаг за шагом схематическое представление флуоресценция основе в пробирке редактирования анализа: (а) гибридизация предварительного редакцией молотка рибозимом (предварительно отредактированы A6Rbz) с его направляющей РНК (gA6Rbz). (Б) признание и взаимодействие РНК дуплекса по очищенной editosome комплекса. (В) Удаление редактирование РНК катализируется editosome. (Г) диссоциация отредактированного A6Rbz от editosome и gA6Rbz при нагревании при 85 ° С и добавлением конкурента направляющей РНК (gA6Rbz_comp). (Е) Гибридизация FRET подложке с активной A6 молот рибозим (активный A6Rbz). (Е) Обнаружение FAM сигналов следующих расщепление FRET подложки активной рибозимом. Б) предварительно отредактированы молот рибозимной (предварительно отредактированы A6Rbz) показан в связи с gA6Rbz, которая определяет удаление трех нас (двуглавый ARROж) с сайта редактирования (ES). В результате редактирования РНК в присутствии функционального editosome неактивный рибозим редактируется в его активную форму (под редакцией A6Rbz), которые теперь могут расщеплять субстрат (FRET сайт расщепления указано стрелкой). Сохраняется 5'-CuGa-3 'редактируемого A6Rbz в каталитическом ядра существенного рибозимную деятельности (под редакцией сайта) будет выделен (Эта цифра была изменена с Мошири 19). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Сигнал-шум сравнению соотношение между FRET субстратов, несущих различную тушители. Рибозим (A6Rbz) деятельность с использованием FAM / TAMRA (F / T) и FAM / Айова Black FQ (F / Ib) субстратов. По оси represeфлуоресценции НТС произвольный единичный (ФАУ) в минуту.
Рисунок 3. Редактирование активность РНК из выбранных фракций, полученных из центрифугированием в градиенте глицерина митохондриального лизата. Фракция № 9 (F9) имеет самую высокую активность. Ось у представляет относительную активность редактирования в процентах, учитывая F9 за 100%.
Рисунок 4. Вычисление Z 'фактор использованием самых активных фракций (F8 + F9 + F10) в качестве источника editosome. Экспериментальное изменение было получено из 72 повторов каждого типа реакции. Z '-фактор был рассчитан как 0,6. Ось у представляет относительную активность редактирования.
Рисунок 5. Репрезентативного эксперимента для флуоресценции на основе РНК-редактирования анализе. Реакции проводили в конечном объеме 20 мкл на лунку и CFX384 TouchTM ПЦР в реальном времени системы обнаружения был использован для измерения сигнала флуоресценции. График представляет различные элементы управления в дополнение к полной реакции редактирования, который содержит все компоненты для теста (# 5). Измеряют флуоресценцию в присутствии субстрата FRET только (№ 1) для оценки целостности подложки. Образец № 2 была проведена в отсутствие editosome контролировать любой рибозимной деятельность до редактирования. Для оценки влияния денатурированного editosome на подложке, измеряли флуоресценцию в присутствии editosome и FRET подложки только (# 3). Для проверки редактирования руководство-направленного специфику, а СэмPLE в отсутствие gA6Rbz был использован (# 4). Без ингибирования (C53, № 6) и тормозным соединение (MrB, № 7) были использованы для оценки влияния на редактирования анализа. В то время как редактирование РНК значительно тормозится MRB, C53 имеет незначительное влияние. Столбики ошибок соответствуют экспериментальной вариации (стандартное отклонение) между 10 повторов. Ось у представляет относительную активность редактирования в процентах, с учетом полной реакции (# 5) за 100%.
| 10% | 30% | |
| 2x HHE градиент буфера | 5 мл | 5 мл |
| Глицерин | 1 мл | 3 мл |
| DEPC H 2 O | 4 мл | 2 мл |
| 1 М DTT | 10 мкл | 10 мкл |
Таблица 1. 10% и 30% раствора глицерина (10 мл каждого).
| Предварительно редактировать A6 Рибозим (preA6Rbz) | |
| Шаблон preA6Rbz ДНК | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz РНК | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| РНК складе конц. | 1 мкм |
| Руководство A6 Рибозим (gA6Rbz) | |
| Шаблон gA6RBz ДНК | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz РНК | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| РНК складе конц. | 2,5 мкм |
| Руководство A6 Рибозим Конкурент (gA6RBz_comp) | |
| Шаблон gA6Rbz_comp ДНК | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp РНК | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| РНК складе конц. | 12.5 мкМ |
| Активность A6 Рибозим (A6RBz) | |
| A6Rbz матричной ДНК | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz РНК | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| РНК складе конц. | 1 мкм |
| FRET подложку | |
| TAMRA утоления | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Айова Черный утоления | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Айова Black-3 '(IDT) |
| РНК складе конц. | 15 мкм (для обоих) |
Таблица 2. Шаблоны ДНК и РНК подложках.
| Состав | Реакция редактированию (мкл) |
| 10x HHE | 1.5 |
| 0,1 М CaCl 2 | 1 |
| 100 мМ АТР | 0,2 |
| 10% Тритон-100 | 0,2 |
| 500 нг / мкл Torula дрожжевой РНК | 1 |
| Editosome | 5 |
| РНКазы H 2 O | 7.1 |
| 1 мкМ preA6Rbz | 1 |
| 2,5 мкМ gA6Rbz | 1 |
| Общий | 18 |
Таблица 3. Состав Реакция и Master Mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Роман высокой пропускной метод скрининга для идентификации ингибиторов против редактирования комплекса РНК трипаносом был представлен, обеспечивая новый инструмент для открытия новых лекарств для борьбы заболеваний, вызванных trypanosomatids. FRET основе Рибозим анализ широко используется для различных целей 20-22; однако, мы использовали потенциал FRET основе рибозимной анализа для мониторинга в пробирке редактирования РНК деятельности 19. Этот анализ может потенциально быть адаптированы к другим типам редактирования РНК у эукариот, таких как редактирование нуклеотидную замену ядра кодированных РНК млекопитающих 23.
Новизна данного анализа не в установлении рибозимов анализов FRET на основе как таковой, а в разработке метода, который включает эту технику в редактирования анализа РНК, которая поддается высокопроизводительного скрининга химических веществ против editosome. Метод анализа на основе Рибозим имеет ряд преимуществ перед другими экранами и попкун я в настоящее время используется для этой цели. В частности, метод предлагает чувствительный и воспроизводимый "сочетание и мера" анализ, опираясь на флуоресцентной подложке, в отличие от радиоактивной меткой один, тем самым делая его пригодным для высокопроизводительного скрининга 19. Мониторинг в реальном времени сигнала флуоресценции после добавления субстрата вместо простой конечной точки сигнала позволяет более точно определить IC 50 значения анализировали соединений 19. Кроме того, это позволяет тестировать ингибирующих эффектов соединений на весь-editosome комплекса в отличие от отдельных рекомбинантных белков. Учитывая динамичный характер взаимодействия внутри белковых комплексов, можно предположить, что этот метод позволяет идентификации ингибиторов против editosome белков в более биологически представителя установка 24. Кроме того, ориентированные на весь-editosome комплекс дает возможность потенциально арестовать прогрессирование редактирования РНКна различных переходных шагов, которые ранее не были идентифицированы. Таким образом, методика позволит набирает лучшую перспективу, чтобы взаимодействий и мероприятий, которые имеют решающее значение для процесса редактирования РНК. Этот подход был найден, чтобы быть успешным в прошлом на примере выяснения прокариот сборки и функционирования с использованием антибиотиков, таких как Viomycin и эритромицин рибосомы комплекса, действуя в качестве ингибиторов комплексного 24,25.
Для обеспечения успешного завершения метода, определенные коррективы в протоколы могут быть необходимы. Во-первых, выбор надлежащего глицерин градиента митохондриальной фракции экстракта имеет решающее значение. Здесь фракции 7 по 11, что соответствует ~ 20S области градиента, показали высокую активность редактирования, с часть 9 экспонирование максимальную активность. Хотя эта фракция была выбрана для всех тестов, представленных, важно, чтобы проверить все фракции заранее, чтобы оценить в каком FRAие редактирования пиков активности. Во-вторых, чтобы подтвердить выбор фракции, очень важно, чтобы выполнить предварительные испытания для оценки отношения сигнал-шум, вычисляя значение Z 'фактор. Если собственно митохондриальная экстракт глицерина градиент фракционирования была завершена, Z 'значение 0,6 может быть достигнута. Далее, рекомендуется пересмотреть объем реакция митохондриальной экстракта, необходимых для достижения максимальной редактирования деятельность через титрования 19.
Важное ограничение методике, представленной в этой статье идет о кропотливой и трудоемкий процесс митохондриального экстракт глицерин градиента фракционирования с помощью которого editosome комплекс очищенной 19. Несмотря на эти недостатки, этот метод преимущественно предложено получить сырой editosome фракций, данные его низкая стоимость по сравнению с потенциалом урожайности, тем самым квалифицируя его для нанесения на высокопроизводительного скрининга. Напротив, другие методы, такие как TAP-тега о.е.rification, которые в состоянии дать более очищенные editosome фракций, рекомендуется применять в низких и средних пропускной анализов, таких, как в случае вторичных анализов. Кроме того, в целях обеспечения конкретной ингибирующее действие соединений, необходимо включить средства управления, чтобы проверить их против активности рибозима (A6Rbz) в отсутствие editosome. Следует отметить, что предыдущие исследования выявили, что данный метод может быть неэффективным при расчете величины IC50 для красителя-подобных соединений из-за возможного вмешательства при высоких концентрациях соединения 19.
Чтобы дополнительно повысить чувствительность метода, представленного HTS, разрабатывает аналогичную флуоресценции на основе анализа с участием предварительно расщепленный предварительно отредактированный рибозим является полезным. Это позволило бы в обход эндонуклеолитического стадии расщепления ограничивающую скорость катализируемой эндонуклеаз в editosome комплекса. Еще одно преимущество этого модифицированного теста будет приложение в качестве вторичного инструмента скринингаконтролировать эффект ингибиторов, выявленных в ходе первичного скрининга на ExoUase, TUTase и лигирования каталитической активности. Предлагаемый в настоящее время анализ ограничен обнаружения ингибиторов против типа удаление редактирования РНК. Таким образом, еще один путь, чтобы исследовать будет модификация представленного анализа для обеспечения мониторинга составных эффектов по типу вставки редактирования РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T.
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A.
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
