Évaluation de la capacité sécrétoire des cellules pancréatiques acineuses

Summary

Acini pancréatiques isolés conservent leur morphologie et l'activité in vivo et offrent des moyens puissants pour surveiller et manipuler la sécrétion. Ce travail démontre comment acini peuvent être isolées à partir du pancréas de souris, et la façon dont les capacités de sécrétion peuvent être évaluées.

Abstract

Les cellules acineuses pancréatiques produisent et sécrètent des enzymes digestives. Ces cellules sont organisées en grappes qui forme et actions une lumière commune. Ce travail démontre comment la capacité de sécrétion de ces cellules peut être évalué par culture de acini isolé. La configuration est avantageuse car acini isolé, qui conservent de nombreuses caractéristiques du pancréas exocrine intact peut être manipulée et contrôlée plus facilement que chez l'animal entier. Une bonne isolation des acini pancréatiques est une condition essentielle pour que la culture ex vivo représentera la nature in vivo des acini. Le protocole démontre comment isoler acini intact par le pancréas de souris. Par la suite, deux méthodes complémentaires pour évaluer la sécrétion pancréatique sont présentés. Le dosage de la sécrétion d'amylase sert de mesure global, tandis que l'imagerie directe de la sécrétion pancréatique permet la caractérisation de sécrétion à une résolution de sous-cellulaire. Collectivement, les techniques PresenTed ici permet un large éventail d'expériences pour étudier la sécrétion exocrine.

Introduction

Le pancréas exocrine qui constitue la majeure partie de la masse du pancréas de mammifère et est dédié à la production et la sécrétion d'enzymes digestives ^1. L'unité fonctionnelle du pancréas exocrine, l'acinus, est un amas de cellules épithéliales qui forment et part une lumière commune. Lors de la stimulation hormonale ou des neurones, des vésicules remplies d'enzymes sont transportés à la surface apicale de la cellule, avec le fusible et expulser son contenu dans la lumière ^{de 1 à 3.} Les enzymes sécrétées sont ensuite drainés par un ensemble de conduits de coalescence dans l'intestin grêle, où elles catalysent la rupture de l'alimentation en substances nutritives.

Cette vidéo montre comment acini intacts sont isolés de l'ensemble du pancréas et de la façon dont leur capacité de sécrétion peut être évaluée. En utilisant cette configuration, la sécrétion pancréatique est quantifiée en mesurant la quantité relative de l'amylase qui a été publié après la stimulation. En variante, la sécrétion peut être visualisé en temps réel par l'utilisation de différentsdes capteurs et des colorants.

L'ex vivo configuration des acini pancréatiques est avantageuse car acini isolé, qui conservent de nombreuses caractéristiques du pancréas intacts, peut être manipulé et contrôlé plus facilement que chez l'animal entier ^4-6. Cette configuration a été développé à l'origine dans la fin des années 1970 et a depuis été étendu à l'étude de plusieurs tissus exocrines telles que la salive et les glandes mammaires ^3-7. Notamment, il permet l'étude de la sécrétion minimisant les interférences avec les organisations cellulaires complexes de ces épithéliums polarisés.

Protocol

REMARQUE: Les procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Institut Weizmann des Sciences. Préparation de l'échantillon 1 Isolement des acini pancréatiques Préparer 300 ml de bicarbonate frais de Krebs-Ringer HEPES (KRBH) moyen avant de commencer. Mélanger 140 mM de NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, glucose 11 mM,…

Representative Results

Acini pancréatiques qui ont été correctement isolé afficher une morphologie stéréotypé lorsqu'il est vu par lumière transmise. Leurs domaines basolatérales doivent apparaître ronde et dépourvue de bulles. Le domaine apical est entouré par des centaines de vésicules de sécrétion et apparaît de couleur plus foncée (Figure 2A, B). Les noyaux gris centraux sont situés dans la région vésiculaire. Les débris cellulaires et les composants du système canalaire pancréatique et du pancr…

Discussion

En plus de la culture ex vivo, des configurations alternatives pour l'étude de la sécrétion exocrine comprennent microscopie intravitale et la mesure de fluides à partir du canal pancréatique. Microscopie intravitale a été montré pour bien fonctionner dans la souris glandes salivaires ^10. Cette méthode permet d'enregistrer en temps réel de la sécrétion dans l'animal intact, mais est limité dans sa résolution et des moyens pour manipuler le tissu exocrine. Évaluation de la s…

Materials

ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808