PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi
Summary
DNA onarım yolları genomik bütünlüğünü korumak ve mutasyon ve kanser önlenmesi için gereklidir. Bu protokolün amacı, metafaz telomerik DNA tekrarlar in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanılarak fare B hücreleri yayılır içinde kromozom anormallikleri doğrudan gözlem ile genomik istikrarsızlık ölçümüdür.
Abstract
Arızalı DNA onarım tümörigeneze yol mutasyonların kök nedenidir genomik istikrarsızlık, artan yol açar. Farklı hücre tiplerinde frekans ve kromozom anormallikleri türü analizi DNA onarım geçiş yollarında bazı kusurların araştırılmasına izin verir. Anlama memeli DNA tamir biyoloji büyük ölçüde spesifik gen knock-out ile farelerin üretimi ile yardımcı olmuştur. Bu protokolün amacı, fare B lenfositleri genomik istikrarsızlık ölçümüdür. PNA-BALIK sondaları (peptid nükleik asit – in situ hibridizasyon floresan) ile telomerlerin Etiketleme metafaz kromozom yayılır genomik istikrarsızlık hızlı analiz kolaylaştırır. Normal ploidi ve daha yüksek bir mitotik indeks çünkü B hücreleri, fibroblastlar göre spesifik avantajları vardır. B hücrelerinin kısa dönemli kültür bu nedenle daha az ikincil genetik mutasyona uğramış ihtimali olan bir birincil hücre popülasyonunda genomik instabilite hassas ölçüm sağlartipik olarak transforme edilmiş fibroblastlar veya hastanın hücre soylarında bulundu olandan s.
Introduction
Kanser, normal hücre gelişimini düzenleyen genlerin etkileyen mutasyonların birikmesine neden olur. Mutasyon DNA'ya hasar görmesinden kaynaklanır genomunun yapısı ve sekansına değişikliklerin bir sonucudur. DNA hasarı örneğin iyonize edici radyasyon gibi, ekzojen maddeler de dahil olmak üzere, çeşitli işlem vasıtasıyla ortaya çıkabilir ve reaktif oksijen türleri 1 ile temas ile oluşan nükleotid baz veya hasar spontan deaminasyonu gibi normal hücresel metabolizma, bir yan ürün olarak.
Memeli hücrelerinin, DNA hasarı tersine veya mola yerlerinde sırası geri yükleyebilirsiniz onarım faaliyetleri bir dizi sahip olmasına rağmen, mutasyonların yine bir hücrenin ömrü boyunca birikir. DNA hasarı, ayrıca, yaşlanma ile ilişkili hastalık 2 ile ilişkili iki işlem, yaşlılık ve kök hücre potens kaybı katkıda bulunabilir. İki işaret adresleme nedenle merkezi öneme DNA hasarının onarımı Anlamakamu sağlığı ificant konular. Artan kanıtlar memeli DNA onarım yolları daha da zorunlu moleküler düzeyde mutasyon bastırmakla alakası süreçleri anlamak için yapım, kanser hücre genomu 3,4 evrimine katkıda düşündürmektedir.
Kromozom anormallikleri doğrudan görselleştirme özel bir hücre türü genomik instabilite ölçüde belirleyen güçlü ve kantitatif bir araçtır. Metafaz hücrelerinden özet kromozomları izole ve ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak kontrol edilebilir. Bu tür yaklaşımlar, sitogenetik birkaç on yıl boyunca uygulamada olmuştur ve translokasyonları veya DNA tamir aktiviteleri kaybı ile ilgili kromozom anormallikleri belirli türleri görünümünü göstermek için kullanılabilir. Protokol birkaç potansiyel uzantıları kendisini ödünç: kromozomlar in situ hibridizasyon spektral karyotip (SKY) veya çok renkli floresan için sondalar ile etiketli olabilir(MFISH) translakosyon 5,6 tanımlamak için. Bu teknikler aynı zamanda bu protokol ile mümkündür ötesinde ek bilgi sağlar kromozom translokasyonların sıklığını ve tespit edilecek kompleks kromozom translokasyonların yapısını, etkinleştirin. Seçenek olarak ise, diziye özgü problar olarak üretilir ve seçilen genomik DNA'sı sitelerinin 7 kopma frekansı test etmek için de kullanılabilir.
Bu protokol, biz metafaz kromozom hazırlanması B lenfositlerden yayılır açıklar. Telomerik tekrarlar için bir fluoresan olarak işaretlenmiş peptid nükleik asit (PNA) sistemi etkin metafaz kromozomda telomerlerin işaretleyen kullanılır Bu protokol, bir çok avantaja sahiptir yayılır. B hücreleri, yüksek kaliteli sürülen sürekli olarak üretilebilir ve böylece yüksek bir mitotik indeksli, büyümesi için teşvik edilebilir. Genetiği değiştirilmiş farelerde B hücreleri de çok daha az katkı analizini bulandırabilir sekonder genetik mutasyonlar içeren muhtemeldirgenomik bütünlük belirli genler. PNA-BALIK yaklaşım bir günde tamamlanmış ve kromozom kırılmaları daha doğru puanlama veriyor olabilir. Özellikle bu protokolde tarif edilen özel ekipmanla birlikte, bu yaklaşım kullanılarak, çok tutarlı, yüksek kaliteli sürülen ürünlerin üretilmesi ve hızlı oranı ve genomik instabilite tür analiz etmek mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aktifleşmiş B lenfositleri, özellikle mitotik kromozom sürülen hazırlamaya uygun olan ise, diğer hücre tipleri de kullanılabilir. T lenfositleri de dalak veya lemf nodlarından saflaştırılabilir gibi, B hücrelerinin avantajları çok paylaşan ve uygun mitojenler 8 ihtiva eden ortam içinde büyüme ile uyarıldıkları zaman, yüksek bir mitotik indeksli sahiptir. Embriyonik Kök hücreler (ES hücreleri) de metafaz kromozom analizi 9 için uygundur. Bu mevcut değilse, colcemid ile d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe R00 CA160574 (SFB) tarafından ve (SMM için) Rutgers Biyoteknoloji Eğitim Programı bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
