Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH
Summary
Vias de reparo de DNA são essenciais para a manutenção da integridade genômica e mutação prevenção e câncer. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica por observação direta de aberrações cromossômicas em metáfase se espalha a partir de células de rato B usando hibridização in situ fluorescente (FISH) para repetições de DNA telomérico.
Abstract
Reparo do DNA defeituoso leva ao aumento da instabilidade genômica, que é a causa de mutações que levam à tumorigênese. A análise da frequência e tipo de aberrações cromossômicas em diferentes tipos de células permite defeitos nas vias de reparo de DNA a ser elucidado. Biologia de reparo do DNA em mamíferos Entendimento foi muito ajudado pela produção de camundongos com nocautes em genes específicos. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica em linfócitos B de ratinho. Rotulagem dos telômeros, utilizando sondas PNA-FISH (ácido nucleico peptídico – hibridização in situ fluorescente) facilita a análise rápida de instabilidade genômica dos spreads metáfase de cromossomos. As células B têm vantagens específicas em relação a fibroblastos, porque eles têm ploidia normal e um índice mitótico elevado. Cultura de curto prazo das células B, portanto, permite a medição precisa da instabilidade genômica em uma população celular primária que é susceptível de ter menos mutação genética secundários do que o que é normalmente encontrado em fibroblastos transformados ou linhas celulares de doentes.
Introduction
O cancro é causado pela acumulação de mutações que afectam os genes que regulam o crescimento de células normais. A mutação é uma conseqüência de alterações na estrutura e seqüência do genoma causada por danos ao DNA. Danos do ADN pode ocorrer através de uma variedade de processos, incluindo agentes exógenos, tais como radiação ionizante e, como um subproduto do metabolismo celular normal, tal como a desaminação espontânea de bases de nucleótidos que ocorram danos ou por contacto com espécies de oxigénio reactivas 1.
Embora as células de mamíferos possuem uma gama de actividades de reparação, que pode reverter danos ao DNA ou restaurar a seqüência em locais de quebra, no entanto, mutações se acumulam ao longo do tempo de vida de uma célula. Danos de DNA pode, além disso, contribuir para a senescência e a perda de potência de células-tronco, dois processos que estão associados com a doença associada ao envelhecimento 2. Compreender a reparação de danos ao DNA é, portanto, de importância central na abordagem de dois sinalquestões ificant em saúde pública. Uma evidência crescente sugere que as vias de reparação do ADN de mamíferos pode contribuir para a evolução do genoma de células de cancro de 3,4, o que torna ainda mais fundamental para compreender os processos envolvidos na supressão da mutação a nível molecular.
A visualização direta de aberrações cromossômicas é um meio poderoso e quantitativos de determinar a extensão da instabilidade genômica em um tipo particular de célula. Cromossomos condensados de células em metáfase pode ser isolado e inspecionados utilizando luz ou microscopia fluorescente. Tais abordagens citogenéticas têm sido, na prática há várias décadas e pode ser utilizado para demonstrar a aparência de translocação ou de determinados tipos de aberrações cromossómicas relacionadas com a perda de actividade de reparação de ADN. O protocolo presta-se a várias extensões possíveis: os cromossomas podem ser marcadas com sondas para cariotipagem espectral (CÉU) ou multicolor hibridização in situ fluorescente(MFISH) para identificar translocações 5,6. Essas técnicas também permitem a frequência de translocações cromossômicas ea estrutura de translocações cromossômicas complexas para ser determinada, que fornece informações adicionais para além do que é possível com este protocolo. Alternativamente, as sondas específicas para a sequência pode ser gerada e utilizada para testar a frequência de quebra de ADN em locais genómicos seleccionados 7.
Neste protocolo, descrevemos a preparação do cromossomo metaphase espalha a partir de linfócitos B. Um ácido nucleico (PNA) péptido sonda fluorescente marcada por repetições teloméricas é utilizado, de forma eficiente, que marca telómeros em cromossomas da metafase espalha Este protocolo tem várias vantagens. As células B podem ser induzidas a crescer em alto índice mitótico de modo que os diferenciais de alta qualidade pode ser produzido de forma consistente. Células B de camundongos geneticamente modificados também são muito menos propensos a conter mutações genéticas secundárias que podem confundir a análise da contribuiçãode genes específicos para a integridade genómica. A abordagem PNA-FISH pode ser concluído em um dia, e permite marcar mais precisa de quebras cromossômicas. Usando essa abordagem, particularmente em combinação com equipamento específico descrito no presente protocolo, é possível produzir muito consistentes, spreads de alta qualidade e analisar rapidamente a taxa eo tipo de instabilidade genômica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Considerando que os linfócitos B activados são particularmente adequados para a preparação de barrar cromossómicas mitóticas, outros tipos de células podem também ser utilizados. Linfócitos T partilhar muitas das vantagens de células B, uma vez que podem ser purificadas a partir dos gânglios linfáticos ou do baço, e têm um elevado índice mitótico, quando estimulada por crescimento em meio contendo mitogénios adequadas 8. As células-tronco embrionárias (células ES) também são adequados pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo NIH conceder R00 CA160574 (SFB) e por uma bolsa do Programa de Formação Biotecnologia Rutgers (a SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
