PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석
Summary
DNA 수리 경로는 게놈 무결성의 유지 보수 및 예방 돌연변이 및 암 필수적이다. 이 프로토콜의 목적은 중기는 텔로미어 DNA 반복위한 원위치 혼성화 (FISH)에 형광체를 사용하여 마우스 B 세포로부터 확산에 염색체 이상을 직접 관찰하여 게놈 불안정성을 정량화하는 것이다.
Abstract
결함 DNA 수리 종양 이어질 돌연변이의 근본 원인 인 게놈 불안정성을 증가하도록 이끈다. 상이한 세포 유형에서 주파수 및 염색체 이상 유형의 분석은 DNA 복구 경로의 결함은 해명 할 수있다. 이해 포유 동물 DNA 수리 생물학이 크게 특정 유전자 녹아웃 생쥐의 생산에 도움이되고있다. 이 프로토콜의 목적은 마우스 B 림프구에서 게놈의 불안정성을 정량화하는 것이다. PNA-FISH 프로브 (펩티드 핵산 – 시츄 혼성화 형광)을 사용 텔로미어의 레이블링은 중기 염색체 스프레드 게놈 불안정성의 신속한 분석을 용이하게한다. 그들은 정상 배수성과 높은 유사 분열 인덱스를 가지고 있기 때문에 B 세포는 섬유 아세포에 비해 특정 장점을 가지고있다. B 세포의 단기 문화 따라서 적은 보조 유전자 변이를 가질 가능성이 차 세포 인구에 게놈 불안정성의 정확한 측정을 가능하게일반적으로 형질 전환 된 섬유 아세포 또는 환자의 세포 라인에있는 것보다의.
Introduction
암은 정상 세포의 성장을 조절하는 유전자에 영향을 미치는 돌연변이의 축적에 의해 발생합니다. 돌연변이 DNA의 손상에 의해 야기 게놈의 구조 및 서열에 대한 변경의 결과이다. DNA 손상 등의 전리 방사선 등 외인성 제제를 포함한 프로세스의 다양한 등을 통해 발생할 수있는 등의 활성 산소 종 (1)과 접촉하여 발생하는 뉴클레오티드 염기 또는 손상의 자발적인 탈 아미 노화 정상적인 세포 대사의 부산물로서.
포유 동물 세포가 DNA 손상 또는 역방향 브레이크 사이트의 시퀀스를 복원 할 수있는 보수 활동의 범위를 갖고 있지만, 그럼에도 불구하고 돌연변이 세포의 수명에 걸쳐 축적. DNA 손상은 또한 노화 – 관련 질환과 연관된 2 개의 프로세스를 노화 및 줄기 세포의 효능의 손실에 기여할 수있다. 이 응답을 어드레스에 따라서 중앙 중요성 DNA 손상의 복구된다 이해공중 보건 ificant 문제. 증거가 증가 포유류의 DNA 복구 경로가 더욱 필수적 돌연변이 분자 수준에서의 억제에 관여하는 과정을 이해하는 데있어 암세포 3,4 게놈의 발전에 기여할 수 있음을 시사한다.
염색체 이상을 직접 시각화는 특정 세포 유형에서 게놈의 불안정성의 정도를 판정하는 강력한 양적 수단이다. 중기에서 세포로부터 연유 염색체 분리 및 광 또는 형광 현미경을 사용하여 검사 될 수있다. 이러한 유전 학적 접근은 수십 년 동안 실제로 왔고 전좌 또는 DNA 복구 활동의 손실과 관련된 염색체 이상 특정 유형의 모양을 보여주기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 몇 가지 잠재적 인 확장에 빌려 준다 : 염색체가 현장 하이브리드의 스펙트럼 핵형 (SKY) 또는 여러 가지 빛깔의 형광에 대한 프로브를 표시 할 수(mFISH)는 전좌 5,6를 식별합니다. 이러한 기술은 또한이 프로토콜 가능합니다 것 이상으로 추가 정보를 제공 염색체 전좌의 빈도와 결정 복잡한 염색체 전좌의 구조를 가능하게한다. 대안 적으로, 특정 프로브 시퀀스가 생성되고 선택된 사이트 7 게놈 DNA에서 파손의 주파수를 테스트하는데 사용될 수있다.
이 프로토콜에서는, 우리는 중기 염색체의 준비가 B 림프구에서 확산에 대해 설명합니다. 텔로미어 반복하는 형광 표지 된 펩티드 핵산 (PNA) 프로브를 효율적으로 중기 염색체에 텔로미어를 표시하는 데 사용되는이 프로토콜은 몇 가지 장점이 펼쳐집니다. B 세포는 높은 품질의 퍼짐 일관 제조 할 수 있도록 높은 유사 분열 지수 성장하도록 유도 될 수있다. 유전자 변형 마우스의 B 세포도 훨씬 덜 기여의 분석을 혼동 할 수 있습니다 차 유전 변이를 포함 할 가능성이있다게놈 무결성의 특정 유전자. PNA-FISH 방법은 하루에 완료하고, 염색체 휴식의보다 정확한 득점을 허용 할 수 있습니다. 특히 이런 프로토콜에 기재된 특정 장비와 함께,이 방법을 사용함으로써, 매우 일관된 고품질의 퍼짐을 생성하고 신속 레이트 및 게놈 불안정성의 유형을 분석 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
활성화 된 B 림프구, 특히 유사 분열 염색체 스프레드의 제조에 적합한 반면, 다른 세포 유형 또한 사용될 수있다. T 림프구가 이들이 비장 또는 림프절로부터 정제 될 수있는, B 세포의 많은 장점을 공유 할 수 있으며, 적절한 8 분열 촉진 물질을 함유하는 배지에서의 성장에 의해 자극 될 때 높은 유사 분열 지수가 있습니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)도 중기 염색체 분석 구에</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 R00 CA160574 (SFB)으로하고 (SMM에) 럿 거스 생명 공학 교육 프로그램의 교제에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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