在小鼠B淋巴细胞染色体畸变所PNA-FISH快速分析
Summary
DNA修复途径对于维持基因组的完整性，防止基因突变和癌症至关重要。该协议的目的是通过直接观察染色体畸变的量化基因组不稳定性在中期从原位杂交（FISH）对端粒DNA重复使用荧光小鼠B细胞的扩散。
Abstract
有缺陷的DNA修复导致增加的基因组不稳定性，这是基因突变，导致肿瘤发生的根本原因。在不同类型的细胞的频率和染色体畸变的类型的分析，可以在DNA修复途径缺陷待阐明。理解哺乳动物DNA修复生物学已经由生产小鼠用在特定的基因敲除极大地帮助。此协议的目的是量化小鼠B淋巴细胞的基因组不稳定性。使用PNA-FISH探针（肽核酸-荧光原位杂交）的端粒的标签有利于基因组不稳定性的中期染色体利差的快速分析。 B细胞有相对的成纤维细胞特定的优势，因为他们有正常的染色体倍性和较高的有丝分裂指数。因此，B细胞的短期培养使基因组不稳定性的精确测量在原代细胞群这很可能具有较少的次级基因突变总比什么通常发现在转化的成纤维细胞或患者的细胞系。
Introduction
癌症是通过影响基因调节正常细胞生长的突变的积累而引起的。突变是变化所引起的DNA损伤的基因组的结构和序列的结果。 DNA损伤的发生原因，通过各种方法，包括外源试剂如电离辐射，和作为正常细胞的代谢，如通过与活性氧1接触存在的核苷酸碱基或损害自发脱氨的一种副产品。
虽然哺乳动物细胞中具有一系列的维修活动的可逆转的DNA损伤或恢复在断裂位点的序列，突变仍然积累在整个细胞的寿命。 DNA损伤可进一步促进衰老和干细胞的效能损失，其中两个是与衰老相关的疾病相关联的进程。在处理两个符号理解DNA损伤的修复，因此至关重要ificant问题的公众健康。越来越多的证据表明，哺乳动物DNA修复途径可以向肿瘤细胞的基因组3,4的演变，使得它更有必要了解参与抑制突变在分子水平上的处理。
染色体畸变的直接可视化是一个强大的和定量测定特定细胞类型的基因组不稳定性的程度手段。从细胞中冷凝的染色体在分裂中期，可以分离并利用光或荧光显微镜检查。这样的细胞遗传学方法已经在实践了几十年，并且可以用于证明易位或特定类型与DNA修复活性的损失相关联的染色体畸变的出现。该协议适合于一些潜在的扩展：染色体可以标记探针光谱核型分析（SKY）或多色荧光原位杂交（mFISH）确定易位5,6。这些技术也使染色体易位的频率和复杂的染色体易位结构来确定，这超出了能够与本协议提供的附加信息。备选地，序列特异性探针可产生和使用在选择的基因组位点7来测试DNA断裂的频率。
在这个协议中，我们描述了编制中期染色体由B淋巴细胞传播。荧光标记的肽核酸（PNA）探针，端粒重复序列的情况下，其有效标记的端粒在分裂中期染色体扩散该协议具有几个优点。 B细胞可以被诱导生长在高有丝分裂指数，使高品质的差可以持续进行制备。从转基因小鼠的B细胞也不太可能包含次要的基因突变，可以颠倒的贡献的分析特定基因的基因组的完整性。在PNA-FISH方法可以在一天内完成，并允许染色体断裂的更准确的得分。通过使用这种方法，特别是与在此协议中描述的特定设备的组合，所以能够产生非常一致的，高品质的差和快速分析的速率和基因组不稳定性的类型。
Protocol
Representative Results
Discussion
而活化的B淋巴细胞是特别适合于制备的有丝分裂染色体涂抹物，其它类型的细胞也可使用。 T淋巴细胞有许多共同的B细胞的优点，因为它们可以从脾或淋巴结进行纯化，并具有高的有丝分裂指数，当由生长在含有适当的促细胞分裂剂8中等刺激。是胚胎干细胞（ES细胞），也适合于中期染色体分析9。如果这些都无法使用，成纤维细胞可以使用，虽然用秋水仙胺更长的治疗（ 例?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院资助R00 CA160574（SFB）和由罗格斯大学生物技术培训计划（到SMM）的奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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