Bioengineering

Analyse de la membrane tubulaire Networks cardiaque myocytes de oreillettes et les ventricules

Published: October 15, 2014 doi: 10.3791/51823

Eva Wagner*^1,2,3, Sören Brandenburg*^1,2, Tobias Kohl^1,2, Stephan E. Lehnart^1,2,3,4

¹Heart Research Center Goettingen, ²Clinic of Cardiology & Pulmonology, University Medical Center Goettingen, ³German Center for Cardiovascular Research (DZHK) partner site Goettingen, ⁴BioMET, Center for Biomedical Engineering & Technology, University of Maryland School of Medicine

* These authors contributed equally

Summary

Dans les myocytes cardiaques, les structures membranaires tubulaires forment des réseaux intracellulaires. Nous décrivons les protocoles pour i) l'isolement des myocytes du cœur de souris, y compris le contrôle de qualité, ii) la coloration de cellules vivantes pour la microscopie de fluorescence état-of-the-art optimisé, et iii) l'analyse d'image directe de quantifier la complexité des composants et la plasticité de la membrane intracellulaire réseaux.

Introduction

Dans les cellules musculaires striées en bonne santé, les structures de membrane tubulaires avec des orientations «transversales» (tubules T) perpendiculaire à l'axe principal de la cellule sont abondants. Par conséquent, T-tubules ont été caractérisés comme des prolongements continus de la cellule de muscle principal "latéral" membrane de surface (sarcolemme), qui pénètrent profondément le cytosol vers le centre de la cellule. Le rôle physiologique de tubules T continu avec la membrane de surface externe est le couplage électrique rapide des compartiments intracellulaires isolées formées par SER organelles domaines de contact à travers le volume relativement important de cellules de muscle cardiaque par couplage de proximité nanométrique de type L de tension activé par le Ca2 ⁺ canaux (Cav1.2) courant entrant (I _Ca) activation des récepteurs de la ryanodine adjacente (RyR2) SER Ca2 ⁺ de presse. Dans les myocytes ventriculaires (VM), les contacts de la membrane non continues («jonctions») entre les domaines de jonction de SER et T-tubules sont pensés pour contrôler des milliers de particuliers Ca2 ⁺ intracellulaire libération nanodomaines dans chaque cellule ^1.

Pour n'importe quel domaine de contact donnée, les portions juxtaposées de la membrane de chaque tube en T et le périphérique (jonction) SER environ 15 nm sont proches les uns des autres, d'où définis comme nanodomaine. Ainsi, de très petits sous-espaces cytoplasmiques individuels sont séparés qui permettent des comportements des compartiments cellulaires autonome quasi. Quand un potentiel d'action entrant active les canaux Cav1.2 dans les tubules T de machines virtuelles, une relativement faible ^{Ca2 +} courant entrant va augmenter rapidement le sous-espace concentration de ^{Ca2 + [Ca2 +]} _S dans le attoliter nanodomaine taille ^1. Ensuite, l'augmentation de _S ^{[2 +} Ca] ^{2 +} Ca -gated active les récepteurs de la ryanodine (RyR2) à l'intérieur du nanomètre dans la proximité de la jonction de la membrane SER juxtaposées, et ce procédé de couplage se produit dans tout coupler électriquementd myocytes nanodomaines. RyR2s surviennent denses grappes multi-canaux avec une stoechiométrie estimée à 1 canal Cav1.2 5-10 canaux RyR2 ^2. Depuis le SER-à-cytosol [Ca ^{2 +]} gradient est très raide (rapport 10 ^4: 1) et RyR2s fonction que de haute conductance Ca2 ⁺ des canaux de libération en grappes fonctionnellement couplés, des résultats d'activation RyR2 dans un grand quantitativement Ca2 ⁺ La version actuelle de T-tubule couplés domaines de SER de jonction de plus en plus sous-espace locale [Ca2 ^+] _S à 100 um ou plus dans 1-2 ms ^3,4. Ce comportement cardiaque d'amplification du signal est également appelé Ca2 ⁺ induite ^Ca la libération (CICR). Dans l'ensemble, T-tubules sont des structures membranaires essentielles qui activent rapidement les signaux de libération ^de Ca à travers des contacts nanodomaine SER jonction et CICR échelle cellulaire lors de l'excitation-contraction (CE) accouplement.

En plus de T-tubules, tube axials (A-tubules) avec une orientation sensiblement parallèle à l'autre axe principal de la cellule (longitudinaux) ont été documentées par microscopie électronique (EM), confocale et études de microscopie deux photons. Par exemple, un réseau continu de grande cellule de A-tubules entre myofibrilles interconnectés avec T-tubules près sarcomériques Z-lignes a été démontré par des traceurs extracellulaires et EM imagerie de Guinée porc fixe VM ^5. Utilisation extracellulaire coloration à la fluorescéine de dextran liés et vivre imagerie 2-photons de rat machines virtuelles, un réseau de tubules 3D réticulaire complexe a été visualisée constitué de ~ 60% tubules T et ~ 40% A-tubules ^6. Cette étude a non seulement conduit à la visualisation 3D des abondantes A-tubules, mais aussi à la prise de conscience que la coupe pour EM visualisation est intrinsèquement limité pour l'analyse des réseaux de membranes complexes et dynamiques comme le système de tube transversal axial (TATS). Par conséquent, l'imagerie des cellules vivantes confocale des membranes TATS directement tachée de di-8-ANNEPS a été développé. Si la cellule en directles réseaux de TATS sont analysés par transformation de Fourier, l'apparence régulière des composants dans l'espace à proximité des lignes de sarcomères Z T-tubule est réfléchie par le spectre de puissance à partir d'un ensemble de signaux striés région ^7. Cette stratégie d'analyse indirect a été utilisé pour détecter les changements régionaux dans l'ensemble des cellules constituant TATS régularité dans des modèles de maladies ^7. Par exemple, shRNA médiation Junctophilin-2 knock-down causé l'insuffisance cardiaque et l'insuffisance de la protéine spécifique de l'isoforme ont abouti à la réorganisation T-tubule avec nanodomaine Ca2 ⁺ dysfonction version ^8. Nous avons récemment étendu l'analyse des réseaux de la membrane TATS par des approches quantitatives directes et en outre en direct microscopie super-résolution de la cellule de composants TATS individuels chez la souris à l'aide de machines virtuelles stimulé l'épuisement d'émission (STED) de nanoscopie ^9. Résolution de l'image nanométrique permis pour l'analyse directe d'éléments plus petits de TATS individu, qui se rapproche d'une distribution de 50:50 transversalecontre orientations des tubules axiaux, confirmant quantitativement deux composants TATS abondantes encore orientés différemment individuels dans les cœurs de souris saines ^9. Ces stratégies seront décrites plus loin dans la partie protocole ci-dessous.

Bien que le rôle physiologique des composants A-tubule abondantes dans le coeur adulte est restée énigmatique, des études ont documenté EM structures membranaires SER associé à un tubules suggérant endogène Ca2 ⁺ nanodomaines de libération en Guinée porc et de rat VM ^5,10. Analyse confocale de Cav1.2 et RyR2 trouvé un haut degré de colocalisation au niveau des jonctions A-tubule ^10. Depuis environ 20% de Ca2 ⁺ spontanées des étincelles chez le rat VM est originaire relativement loin de stries Z-ligne où T-tubules se produisent généralement, un argument a été que nanodomaines A-tubule associés peuvent en effet exister et de fonctionner comme Ca2 ⁺ sites de libération ^11,12. Fait intéressant, la formation des tubules T-oc et maturationroquets seulement après la naissance et est parallèle à la croissance des cellules cardiaques, par exemple, à travers la germination des invaginations précurseur sarcolemmiques à P5 et immature ramifiés assemblées réseau TATS à P10 chez la souris ^13. Il semble que Junctophilin-2 est particulièrement important pour postnatal maturation de réseau TATS depuis shRNA knock-down empêcher l'ancrage des membranes T-tubules de jonctions SER conduisant à Ca2 ⁺ à libération retardée et de l'organisation de TATS pathologique compatible avec les architectures immature A-tubule dominées par VM ^13. Ces observations peuvent finalement conduire à la preuve de concept que T-tubules forment par des processus invagination de la membrane, tandis que A-tubules peuvent se transformer grâce à des mécanismes intracellulaires supplémentaires ou même d'autres ^14.

Caractérisation de tatouages modifications de la membrane dans la maladie cardiaque est devenue un domaine de recherche important pour les questions physiopathologiques. Les rapports initiaux dans un modèle de coeur failu induit une stimulation chienre a montré une perte de tubules T et le courant Cav1.2 (I _Ca) ^15. Un modèle porcin de cardiomyopathie ischémique a montré une diminution des densités de T-tubule et une synchronie réduit de Ca2 ⁺ intracellulaire de presse ^16. En utilisant un modèle de rat spontanément hypertendu (SHR) de l'insuffisance cardiaque, une perte de tubules T est associée à couplage de nanodomaine réduite de Cav1.2 et RyR2 par le mécanisme proposé de "RyR2 orphelins» ^7. Une perte de tubules T a également été démontré dans des machines virtuelles à partir d'échantillons humains cardiomyopathie ischémique, dilatées, hypertrophiques et ^17. En outre, une augmentation de la A-tubules a été signalé dans des coupes de tissus de cardiomyopathie dilatée humaine ^18. Après un infarctus du myocarde, nous avons montré un mécanisme différentiel de réorganisation TATS chez la souris VM à une diminution significative de T-tubules contrairement aux augmentations des composants A-tubule ^9. Surtout, contraste amélioré de membrane locale réalisée par superre de cellules vivantessolution STED microscopie a permis une analyse quantitative détaillée des composants par des mesures directes, qui ont montré une prolifération importante de l'A-tubules avec l'augmentation globale de la longueur du réseau de TATS et de branchement complexité ^9. En outre, il a été montré que l'entraînement physique peut inverser T-tubule remodelage chez le rat après un infarctus du myocarde ¹⁹ et que la thérapie de resynchronisation cardiaque peut conduire à inverser la rénovation des tubules T chez les chiens atteints auriculaire tachypacing insuffisance cardiaque induite par ^20. Dans l'ensemble, les études à la fois dans les interventions thérapeutiques potentiels humains malades et des animaux ainsi que les machines virtuelles seront sans doute bénéficier de procédures d'isolement cellulaire de haute qualité et des stratégies d'analyse quantitatives détaillées comme indiqué dans le protocole et les résultats des sections ci-dessous.

En outre, comme l'a démontré récemment surface latérale contre TATS trafic membranaire de canaux KATP isoformes ^21, il est important de considérer m auriculaireyocytes (AMS) comme biologiquement distincte ainsi que le modèle de cellule cardiaque comparative versus machines virtuelles. T-tubules ont été récemment documentés chez les ovins et les AM humaine ^22. Les données actuelles suggèrent que quelques tubules-T existent dans les cellules AM et généralement dans les grands mammifères comme des moutons et des humains, mais pas chez les petits rongeurs ^23. Contrairement aux machines virtuelles, MA en Ca2 ⁺ intracellulaire libération semble se produire à partir de la multiplication de la surface de la cellule par diffusion vers le centre de la cellule marquée qui se traduit par Ca ^{2 +} spatiale et temporelle des gradients de ^23. Dans ce cadre, il semble important d'élucider les mécanismes de Ca2 ⁺ intracellulaire instabilité des formes de maladies communes de signalisation tels que la fibrillation auriculaire ^24. En résumé, à la fois l'isolement cellulaire AM et VM et chacun pour un cœur en santé et malades sont couramment utilisés protocoles. Seulement si l'isolement cellulaire est fait correctement à en juger par la documentation microscopique de la qualité de cellule suffisante, les échantillons AM et VM doivent être carried avant pour l'analyse quantitative de TATS. En conséquence, les sections de protocole suivantes est essentiellement dépendante de la cellule de haute qualité isolats de souris ou d'autres espèces, suivie par microscopie de cellules vivantes pour analyser les membranes intactes TATS. Comme indiqué précédemment, la caractérisation des membranes TATS est un domaine de recherche difficile avec une propension pour fixation et de préparation des artefacts ^6, les changements de la membrane en raison de modifications osmotiques, et les limites de résolution de la microscopie optique conventionnelle ^9. Nous notons que les protocoles sur l'état de l'art des dernières pour l'isolement de MA humaines pour Ca2 ⁺ imagerie et de patch-clamp et de rat machines virtuelles pour la culture cellulaire ont été publiés dans cette revue ^25,26.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle du Centre médical universitaire de Göttingen en conformité avec la prise en charge humaine et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1 Isolement des myocytes auriculaires et ventriculaires du coeur de souris

Manipuler les animaux aussi doucement que possible et selon des protocoles approuvés pour minimiser le stress en général et en particulier pour éviter les effets involontaires puissants potentiels par les excès neurohormonales sur les cellules cardiaques isolées. En outre, l'injection de chaque souris avec de l'héparine (500 IU / kg de poids corporel sc) au moins 20 min avant l'extraction du coeur pour empêcher la coagulation du sang et des micro emboles qui peut compromettre de manière significative le rendement et l'intégrité des cellules cardiaques au cours de l'isolement.
Anesthésier souris âgées de 12 semaines ou plus par inhalation d'isoflurane, confirmer l'absence de réflexes de retrait de la douleur, et euthanasier les animaux par dislocation cervicale.
1. Extraire le coeur rapidement en suivant les protocoles d'experts précédemment établies (par exemple, voir Kaestner et al. ²⁶ et Louch et al. ^27). Éviter tout dommage accidentel aux oreillettes par compression ou étirement inutile.
2. Conserver soigneusement le tissu de la aorte ascendante proximale en utilisant une paire de pinces et des ciseaux de souche droites à établir une arête de coupe transversale continue à travers la paroi du vaisseau de l'aorte, ce qui est important pour la réussite et la canule de perfusion du coeur.
Transférer le coeur a été excisé immédiatement dans la glace-froid nominalement Ca2 ⁺ tampon de perfusion sans (pour les solutions voir le tableau 1). Gardez les gros vaisseaux serrés pendant le transfert dans l'air dans la zone tampon pour éviter par inadvertance embolie gazeuse jusqu'à ce que le coeur est entièrement submergé. Utilisation BDM dans les solutions tampon et de glace refroidi à inhiber la contraction cardiaque.
Utiliser un microscope binoculaire avec zoom illum 3D suffisantemination.
1. Cathétériser l'aorte sous stéréovision panoramique sur le cœur avec une surface lisse et polie 21 G canule (diamètre extérieur de 0,81 mm, par poids du cœur de souris normale) qui doit être complètement rempli avec le tampon. S'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la canule en reliant un réservoir de solution proximale (par exemple, une seringue) par une 2 voies Luer valve permettant le contrôle des flux de solution rapide.
2. Confirmez la loupe binoculaire que la canule est correctement positionné dans l'aorte, qui est d'environ 1 mm au-dessus des valves aortiques et les branches des artères coronaires. Absolument éviter tout passage ou de perforation accidentelle des valves aortiques avec la canule (ce sera perturber de façon permanente la fermeture de la valve aortique et par conséquent perturber la perfusion cardiaque).
Attachez l'aorte doucement pour rainures antidérapantes orientée à la circonférence fait sur mesure, à proximité de l'extrémité de la canule en utilisant deux points de suture soie. Ne jetez pas la arteri coronairees avec force à tout moment. Connectez la canule de solution rempli liée à l'aorte et le cœur à un connecteur de sortie hermétique d'un système de perfusion personnalisée et pré-calibré, alias la configuration Langendorff modifié (soit en utilisant une pression constante ou un débit constant; voir également la section de discussion ci-dessous).
Perfuser le coeur le plus tôt possible pendant 4 min en utilisant un tampon de perfusion oxygénée à 37 ° C (débit de perfusion cible: 4 ml / min). Lancer la digestion par la commutation de perfusion contenant de la collagénase tampon de digestion (600 U / ml de collagénase de type II) de 8 à 10 min à 37 ° C. Surveillez la progression de la digestion du tissu en confirmant les modifications tissulaires similaires, y compris l'augmentation opacité, la douceur et la flaccidité sur toute la surface du cœur apparent.
Disséquer les cavités cardiaques que la digestion suivant les besoins. Placez le coeur canule sous un microscope binoculaire et de visualiser la paroi cardiaque postérieure. Disséquer résiduelle non cardiaque tissus par exemple, un poumone éléments du navire pour éviter la contamination de cellules dans le tampon de digestion en utilisant des micro ciseaux (par exemple, ciseaux à ressort avec 8 mm lames droites) comme le montre la figure 1.
Suivez une liste de contrôle qui particulier les chambres, les régions et / ou des cellules du cœur de la collagénase digéré doivent être récoltées (Figure 1): à gauche et / ou l'oreillette droite, libre à gauche et / ou de la paroi du ventricule droit, et / ou le septum ventriculaire.
1. Pour la dissection de tissus cardiaques spécifiques, en utilisant un bain de dissection relativement large et plat revêtu d'une couche épaisse de quelques mm de matière plastique élastomère de silicone. Fixer la pointe du cœur avec une tige en acier insecte bien à la couche d'élastomère bas.
2. Détourner l'appendice auriculaire droit et disséquer l'oreillette droite juste au-dessus des valves auriculo-ventriculaires. Continuer la dissection de l'oreillette gauche. On dissèque et jeter le dispositif de soupape fibreux. Enfin, disséquer les parois ventriculaires libres gauche et droite et le septum et / ou petiter des pièces de tissu au besoin.
3. Remarque que pour les stagiaires: pour acquérir de l'expérience, commencez avec des coeurs de souris non-digérés. Pour faciliter l'orientation anatomique, pratiquer la manipulation des tissus, y compris toutes les étapes de dissection consécutifs en vertu de la vision binoculaire, comme illustré à la figure 1. Une fois l'anatomie 3D, la manutention manuelle dans la vision binoculaire, et les étapes de dissection sont suffisamment familiarisés, continuer avec les collagénase digéré coeurs de souris que décrit ci-dessus.
Pour les myocytes ventriculaires (VM) l'isolement de cellules: transférer le tissu ventriculaire dans 2,5 ml de tampon de digestion fraîche. Si isolements cellulaires simultanées de plusieurs parties d'organes, par exemple, oreillettes et ventricules est tenté, une deuxième personne peut prendre plus d'une jambe de la procédure de dissociation des cellules, à la fois pour minimiser et optimiser l'utilisation de la souris grâce à un traitement coordonné des tissus cardiaques multiples. Passez aux étapes 1.9.1-1.9.4, par la suite 1.10.
1. Disséquer soit le tissu ventriculaire ensembleou des parties spécifiques de celui-ci (par exemple, LV, RV, murs libres, et / ou septum) dans environ 1 mm ³ pièces dans 2,5 ml de tampon de digestion à l'aide de ciseaux pointus (par exemple, ciseaux à ressort avec 8 mm lames droites) dans un plat de 60 mm de Pétri .
2. Dissocier les machines virtuelles doucement en suspension les cellules par trituration lente de morceaux de tissu avec une pipette de transfert. Éviter toute formation de bulles d'air dans la suspension de cellules.
3. Ajouter 8 ml de tampon d'arrêt de la suspension de cellules VM et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Laisser les morceaux de tissu restent à se déposent au fond de l'ordre de 15 secondes, mais suffisamment courte pour que les cellules isolées à rester en suspension. Ensuite, la suspension récolter VM par transfert du volume de surnageant dans un nouveau tube de 15 ml. Si les morceaux de tissu excessives sont présentes, en variante, utiliser une maille de nylon de 200 um peu espacées pour séparer les morceaux de tissu à partir de la suspension cellulaire.
4. Soit la suspension de cellules VM se déposent au fond de 15 ml d'une coTube nique par gravité pendant 8 min.
5. Lavage: éliminer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot restant VM dans 10 ml de tampon de perfusion. Étape de lavage Répétez 1.9.5 (en option: ajouter des étapes de lavage supplémentaires pour augmenter progressivement la concentration de Ca2 ⁺ au besoin).
6. Remettre en suspension le culot dans du tampon VM constante de perfusion de 10 ml et le volume de distribution de la suspension de cellules restant dans 1,5 ml microtubes (environ 50 000 cellules par tube VM).
Pour atrial myocytes (h) l'isolement de la cellule: transférer le tissu auriculaire digéré / disséqué dans 1 ml de tampon de digestion fraîche.
1. Couper le tissu auriculaire à une digestion partielle d'environ 1 mm ³ morceaux dans un tampon de digestion de 1 ml à l'aide de micro ciseaux dans une petite boîte de Pétri (par exemple, 60 mm de diamètre). Dissocier les cellules AM doucement sur les morceaux de tissus digérés dans la suspension de cellules à l'aide d'une trituration avec une pipette en plastique de 1 ml avec un embout de coupe pour éviter d'endommager des jets de fluide. Pendanttrituration à éviter strictement tout barbotage d'air dans la suspension de cellules. A la suite d'une agitation mécanique, ajouter 4 ml de tampon d'arrêt (50 pM de _CaCl2, 10% de BCS) pour arrêter toute activité de la collagénase en restant dans la suspension de cellules.
2. Transférer la suspension cellulaire dans un tube AM conique de 15 ml. Laisser les morceaux de tissu restent à se déposent au fond de l'ordre de 15 secondes, mais suffisamment courte pour que les cellules isolées à rester en suspension. Récolter le volume de surnageant contenant les cellules AM libres via le transfert de la solution dans un nouveau tube de 15 ml.
3. Centrifuger la suspension cellulaire AM, par exemple, 2 min à 20 g à la température ambiante ou - de préférence pour des études de membranes - de laisser les cellules se déposent par gravité vers le bas lentement pendant 20 min dans un tube conique de 15 ml.
4. Laver étape: éliminer le surnageant et remettre le culot en douceur AM dans 5 ml de tampon de perfusion. Répétez 1.10.4.
5. Remettre en suspension les cellules AM doucement dans le tampon de perfusion de 5 ml. Distribuer le volume de suspension cellulaire dans 1,5 ml microcentrifuge baignoirees (environ 1000 cellules AM par tube).
Analyser et documenter la qualité isolé de la population de cellules pour chaque cardiaque, y compris le rendement de la cellule en utilisant une coloration au bleu trypan.
1. Pour cela, diluer 500 ul de la suspension cellulaire à 1: 1 vol / vol avec solution de bleu trypan (concentration finale de 0,02%) en utilisant 1 ml de pointes de pipettes de coupe. Mélanger les cellules et le bleu trypan doucement en très ralentir pipetage / bas. Appliquer immédiatement le bleu trypan suspension contenant des cellules à un type Neubauer améliorée cytomètre et compter les myocytes intacts à l'aide d'un microscope inversé.
2. Exclure les cellules avec des dommages apparents, bulles membranaires, stries perturbé, contractures, et les cellules qui s'accumulent au bleu trypan intracellulaire (figure 2). Également exclure les cellules, qui sont sensibles à la mort de la cellule se contractant spontanément. Pour évaluer le nombre de cellules intactes en suspension, utiliser uniquement des myocytes cardiaques avec des stries régulières qui excluent bleu trypan tout au long dele volume de la cellule.
Juger de l'intégrité de auriculaires et ventriculaires individuels myocytes par microscopie lumière transmise. Enregistrez l'image en champ clair dans un fichier Tif pour la documentation et une analyse plus approfondie.
1. Utiliser les critères suivants pour l'analyse de l'intégrité des cellules cardiaques:
  1. confirmer la présence de stries périodiques dans tout le volume de la cellule visible;
  2. confirmer l'intégrité continue de la membrane de la surface latérale des deux côtés de la cellule parallèlement aux myofilaments;
  3. visualiser dentelures tranchantes sur les disques intercalaires sur les deux côtés de la cellule qui reflètent l'intégrité des structures spécifiques de la membrane de surface; et
  4. visualiser les signaux fluorescents des membranes TATS (ou immuno-cavéoline-3 protéines ou d'autres marqueurs de membrane) comme décrit dans l'article 3 de la localisation corrélation à côté du champ lumineux d'image morphologie spécifique des cellules du sous-jacent (par exemple, combiner les deux images avec ImageJ comme superposition imag composée).
  5. Déterminer la longueur de sarcomère des images de champ lumineux. Pour une longueur de sarcomère moyenne, mesurer la distance de manière séquentielle alignée stries des sarcomères, et diviser la distance par le nombre de sarcomères. Mesurer au moins deux endroits par cellule. Effectuer l'analyse avec les logiciels commerciaux ou hors ligne avec ImageJ.
    NOTE: En cas de traitement avec des agents de découplage, intact détendue machines virtuelles de cœur de souris montrent une longueur sarcomère moyenne de ~ 1,9 um ^28.
Quantifier la morphologie et les dimensions des myocytes auriculaires et ventriculaires individuels de l'image lumineuse transmise de microscopie. Considèrent que les cellules AM et VM diffèrent considérablement en taille. Mesurer la longueur de la cellule, la largeur et la région, et calculer la longueur: largeur.
1. Analyser les dimensions de la cellule 2D de l'image lumineuse transmise dans ImageJ en utilisant l'outil de sélection des commandes de polygone et ajouter de gestionnaire de ROI, analogue à la figure 3. Si c morphologiquees changements sont attendus dans les contextes spécifiques de l'étude, autre document pour toutes les cellules de la souche spécifique de la souris, l'âge, le sexe, la taille du cœur, et des interventions pour la classification ultérieure des données.

2. coloration de tatouages membranes dans la vie auriculaire et ventriculaire myocytes

Charger la chambre d'imagerie (par exemple, COP-R2) avec une lamelle de verre de 42 mm. Pour la fixation stable des myocytes à la lamelle couvre-objet, préparer 20 pi d'une solution de laminine par une dilution à 1:10 de la laminine stocks dans le tampon de perfusion physiologique (concentration finale 0,2 mg / ml). Etaler 20 ul de la solution de laminine uniformément sur la lamelle de verre.
Préparer 800 ul d'une solution à 50 uM de di-8-ANEPPS dans un tampon de perfusion. Pour cela, diluer 20 pi de di-8-ANEPPS solution mère 2 mM dans un tampon physiologique 780 pi.
Pour colorer les machines virtuelles, que les cellules se déposent par gravité pendant 8 min dans un tube de 1,5 ml de réaction. Pour colorer MA, soit utiliser la sédimentation par gravité ou spdans la suspension de cellules pendant 2 minutes (voir 1.10.3). Pour les deux AM et machines virtuelles, retirez délicatement le surnageant tout en évitant l'agitation inutile de le culot de cellules et remettre délicatement le culot cellulaire dans 800 ul de di-8-ANEPPS contenant une solution (50 M). Transférer immédiatement le di-8-ANEPPS / myocytes suspension sur la lamelle couvre-objet de la laminine-enduit dans la chambre d'imagerie.
Colorer la suspension VM pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
Retirer lentement le volume en excès par le ménisque de fluide vers le haut sur les côtés de la chambre de formation d'image avec une pipette manuelle. Assurez-vous que la majorité des myocytes di-8-ANEPPS colorées reste fermement attaché à la lamelle de la laminine-couché et ne soient pas exposés à l'air. Ensuite, laver la suspension de myocytes fixé une fois par addition lente de 1 ml de tampon de perfusion suivie d'enlèvement de l'excès de liquide, y compris les cellules non adhérentes.
Superposer attentivement les myocytes colorées et attachés surface avec 1 ml de tampon de perfusion lentement du côté de til Imagerie chambre. Placer la chambre d'imagerie sur la platine du microscope.

3. imagerie de TATS membrane Structures en vie auriculaire et ventriculaire myocytes

En général, choisir avec soin la meilleure option possible du microscope à fluorescence (s) disponible pour TATS imagerie de la membrane. Pour l'imagerie confocale, envisager génération récente, microscopes à fluorescence modernes avec optimisées PMT détecteurs matriciels et les voies photon de recyclage qui maximisent l'intensité du signal fluorescent. Pour l'imagerie confocale de petits détails de tatouages structures membranaires utilisent un objectif 63X huile 1,4 NA ou - selon disponibilité - utiliser un super-résolution microscope STED pour les plus petits détails de TATS tel que révisé pour applications spécifiques myocytes par Kohl et al ³⁴ Pour les principes généraux de haut. microscopie de fluorescence de la résolution, reportez-vous à la section de discussion.
Réglez les paramètres d'imagerie pour détecter la plupart, idéalement tous les mem intracellulaire di-8-ANEPPS teintébranes l'intérieur d'un plan d'imagerie des myocytes donné. Utilisez les paramètres suivants comme point de départ pour la microscopie confocale à balayage laser de départ: excitation 458 nm par exemple, à 3% de la puissance laser maximale; détecter le signal émis entre 550 nm et 740 nm; gain du détecteur (par exemple, commande maître 800); et sténopé 1 UA pour une épaisseur de coupe optique à 900 nm. Ajuster ces paramètres afin d'optimiser le rapport signal-bruit.
Utilisez le mode de champ lumineux pour sélectionner AM intact ou cellule VM, le cas échéant (figures 4A et 4B). Se référer au point 1.12 de critères pertinents Comment juger de l'intégrité de la cellule à sélectionner des cellules comme le résume: stries régulières au niveau cellule et l'espacement des sarcomères égal, des bords de surface pointus et des stries sur les quatre côtés de la cellule, l'intégrité continue de la membrane de surface latérale, et l'absence de des vésicules membranaires.
Prenez une photo de l'échantillon d'une section centrale de myocytes intracellulaire. Pour régler le ROI utiliser la "culture" fonction →; Ajuster la fenêtre de recadrage → la taille finale du pixel mesure 100 nm x 100 nm. Ajuster l'axe des x de la fenêtre de recadrage pour correspondre à la plus grande (axial / longitudinal) de l'axe des myocytes.
Sélectionnez le plan de l'imagerie finale. Utilisez des cadres d'une seule image à sélectionner manuellement le plan d'imagerie appropriée dans la direction z. Confirmer que les membranes TATS-T, y compris les tubules et les composants A-tubule, sont visuellement apparente dans le plan focal. A noter qu'un plan d'imagerie intracellulaire typique peut comprendre un noyau en tant que point de référence intracellulaire. Reportez-vous aux exemples des figures 4A et 4B.
NOTE: En général, maintenir l'exposition des cellules à une lumière laser le plus court possible. Si possible, utilisez des trames d'image simples pour déterminer le plan focal optimal dans les myocytes cardiaques.
Réglez le temps de séjour de pixels à environ 0,5 microsecondes. Sélectionnez 16x moyenne et enregistrer l'image comme instantané. Répétez l'étape image instantanée d'établir l'imagerie appropriée plan unes décrit des structures membranaires TATS à 3,5 selon les besoins.
Enregistrer l'image finale et confirmer que le fichier a été enregistré dans son dossier cible. En général, enregistrer tous les fichiers d'image dans le même format (par exemple, LSM) pour l'application uniforme de logiciels d'analyse. Avant toute analyse de l'image, une fois de plus confirmer l'intégrité des cellules suffisante off-line (tenir compte des critères énumérés à l'étape 1.12.1) et exclure les cellules endommagées de l'analyse. Reportez-vous aux exemples des figures 4C et 4D.

4 Analyse de la membrane Réseau TATS et de ses composants

Les étapes suivantes de traitement d'image pour l'analyse directe de tatouages composants de la membrane sont résumées ci-haut vers le bas diagramme du processus sur les figures 5A et 5B.

Ouvrez le fichier d'image d'un myocytes teinté di-8-ANEPPS à Fidji (http://fiji.sc/), une variante librement disponible de ImageJ qui contient les plugins d'analyse essentiels pourtraitement de l'image. Pour de plus amples informations s'il vous plaît se référer à Schindelin et al ^29.
Enregistrez l'image → Fichier → Enregistrer sous → Tif.
Pour analyser les composants de la membrane TATS, sélectionnez le retour sur investissement approprié à l'exclusion du signal de la membrane de surface externe, puis utilisez l'outil "polygone de sélection" pour délimiter la frontière ROI exclusion de la membrane de surface extérieure (sarcolemme) et y compris les parties intracellulaires des membranes TATS comme indiqué dans Figure 5A (ROI). Ajouter le ROI sélectionné pour le "Gestionnaire de retour sur investissement" en appliquant Analyser → Outils → ROI Manager.
1. Pour sélectionner un retour sur investissement spécifique pour l'analyse de l'orientation des composants TATS, aligner l'axe longitudinal de la cellule principale et l'axe des x l'image en parallèle. Si la cellule est légèrement courbé, sélectionnez plusieurs ROI et aligner chaque ROI individuellement. Exclure les noyaux de l'analyse. Exclure les cellules trop courbes de l'analyse car l'alignement précis de RIO deviendra de plus en plus difficile et augmenter les erreurs d'orientation en cours d'analyse.
Supprimer les informations de signal parasite de la membrane de surface extérieure: Édition → Effacer l'extérieur pour générer le "ROI sélectionnée" (figure 5A). Assurez-vous que le retour sur investissement sélectionné ne contient que les parties de membrane intracellulaire, qui correspondent avec le réseau de TATS.
Effectuer la chaîne d'étapes de traitement d'image (commandes) avant l'analyse quantitative ultérieure comme indiqué dans la figure 5A suivante.
1. Cliquez sur → Processus → Contexte Soustraire. Définir le rayon de Roulements à billes à 5 pixels.
  REMARQUE: Réglez le rayon de bal à 5 pixels si l'image à être analysé a une taille de pixel de 100 nm x 100 nm. Pour d'autres dimensions de pixel définir le rayon de roulement à billes pour le nombre de pixels qui correspondent approximativement à un rayon de 500 nm physique.
2. Cliquez sur → Processus → améliorer le contraste local (CLAHE). Définissez la taille de bloc de 49, les histogrammes à 256, la pente maximale de 3, et le masque de "none".
3. Cliquez sur → Processus → lisse.
4. Cliquez sur → Plugins → → Segmentation Région statistique Fusion. Réglez les paramètres de Q100 → cliquez sur Afficher les moyennes.
5. Confirmez le traitement complet de la région statistique la fusion indiqué par la présentation automatique d'un nouveau cadre d'image et confirmer que l'étiquette «SRM Q = 100" apparaît. Continuer les étapes suivantes avec ce fichier d'image. Cliquez sur l'image → → → Type de 8 bits.
6. Cliquez sur l'image → → → Réglez Seuil. Choisissez le seuil suffisamment bas pour détecter la plupart, idéalement tous les TATS structures, en particulier l'exclusion évitent de composants TATS avec une faible intensité du signal (utiliser un seuil de 40 comme point de départ). Consultez la section «Les résultats représentatifs" pour la sortie de données détaillée et les exemples de la figure 6(Seuil supérieur de 255). Documenter le choix final des paramètres de seuil. Notez que le choix correct de seuil devrait produire des structures spécifiques uniquement de la membrane TATS mais pas de faux signaux positifs en raison du bruit de fond.
7. Confirmez superposition correcte de TATS détails d'image par rapport à des données extraites de squelette, en particulier pour les niveaux de signal de fluorescence intermédiaire et élevé, ce qui devrait correspondre à la (écran) la continuité de la structure de squelette. Une fois un seuil approprié a été identifié, appliquer ce même seuil pour toutes les images lors de l'analyse et de répéter la comparaison de superposition du signal original par rapport aux données de squelette pour minimiser systématiquement cette source potentielle de biais.
8. Cliquez sur Appliquer →: les données d'image devient binaire comme le montre la Figure 5 sous «Seuil».
9. Cliquez sur → Plugins → → Skeleton squelettisent (2D / 3D). Enregistrez l'image 2D squelette (comme le montre la Figure 5) sous forme de fichier Tif parcliquant sur → Fichier → Enregistrer sous → Tif. Analyser le fichier image squelette pour la sortie de données quantitatives en cliquant sur → Plugins → Analyser Skeleton (2D / 3D). Choisir la méthode de cycle Prune: aucun. Confirmer la génération automatique de la table de données qui en résulte.
10. Enregistrez la table de données généré automatiquement en fichier txt. Sélectionnez les paramètres quantitatifs pertinents, par exemple, le nombre total de points de branchement ou la longueur de la branche moyenne comme le montre par des exemples de données dans la figure 7. Envisager une analyse plus approfondie des données avec l'appui des outils complémentaires / logiciels comme Excel et le cas échéant.
Envisager d'utiliser des routines de traitement automatisé de l'image à chaque fois que possible, y compris toutes les mesures nécessaires décrits à la rubrique 4.5 pour harmoniser l'analyse entre les images individuelles et / ou lots d'images. Utilisez l'exemple de fichier de code supplémentaire contenant une macro de traitement d'image programmé pour Fidji (ajuster la programmation en fonction des besoins).
Analyser le dansorientations individuelles de tous ou certains composants du réseau TATS à partir des données d'image squelettisées par le Fidji plugin "directivité". Générer un histogramme de la directivité, où le A-tube d'orientation axiale respective ou les composants de T-tubule orientées transversalement sont représentés par des 0 ° ou 90 ° des bacs. Notez la référence correcte de l'orientation de l'image et qu'il est important pour l'axe des x de l'image pour correspondre étroitement avec les principales longitudinales (0 °) de l'axe de la cellule VM comme représenté sur la figure 8 et les résultats représentatifs.
1. Cliquez sur → Analyser → → directivité précise Méthode: composantes de Fourier, Nbins 180, histogramme commencer -45 → cliquez sur la table d'affichage.
2. Enregistrez le tableau des résultats nouvellement généré et affiché, y compris celles de l'histogramme associés sous forme de fichier txt. Pensez à une analyse plus approfondie des données du fichier txt par des outils logiciels gratuits comme Excel et selon les besoins.
Pour générer les sous-classes d'données sous forme de jeux regroupés par exemple, pour toutes les cellules traitées dans les mêmes conditions (et potentiellement d'autres conditions), répéter l'analyse étapes 4.1-4.7 pour toutes les images pertinentes, le cas échéant. Importer les paramètres de données squelettisées de toutes les images dans un fichier combiné Excel pour calculer les valeurs moyennes. En outre, importer toutes les données directivité de l'histogramme de la même ensemble de données regroupées dans un fichier combiné Excel pour calculer et générer l'histogramme de directivité moyenne. Examiner plus avant le traitement d'ensembles de données groupées pour analyser d'autres paramètres de réseau TATS d'intérêt pour les différents groupes de traitement individuels ou entre au besoin.

Representative Results

En outre, l'analyse de réseau membrane TATS un certain nombre de techniques de biologie cellulaires couramment utilisés comme Ca2 ⁺ intracellulaire imagerie, patch-clamp électrophysiologie, ou études dose-réponse pharmacologiques dépendent essentiellement sur l'isolement de cellules primaires de haute qualité des oreillettes ou les ventricules ou sélectionnez parties de tissu cardiaque afin de permettre la caractérisation des myocytes cardiaques différenciées intactes, structurellement et physiologiques matures. Par conséquent, l'évaluation de l'isolement et de la qualité des cellules AM et VM décrites à l'article 1 sont finalement utile pour de nombreuses questions, y compris l'analyse de réseau TATS décrite ici, qui dépend essentiellement de membrane intacte et l'intégrité de la cellule.

La figure 1 présente un manuel étape par étape d'images comment procéder à la dissection du tissu cardiaque à commencer par les chambres auriculaires dans le cœur de la souris. Par la suite, les cavités ventriculaires et la cloison sont préparés uneD disséqué au besoin. Sélection et la préparation des pièces de tissus correctes précis est important d'établir de manière fiable AM et VM isolements de pureté des cellules suffisant. Après digestion à la collagénase, il peut être relativement difficile d'identifier la bonne ligne de dissection entre auriculaire et tissu ventriculaire, encore une fois les cellules AM et VM sont mélangés incontrôlée en suspension de cellules, il est impossible de renverser la population de cellules mixtes. Par conséquent, l'orientation anatomique, la visualisation d'un tissu 3D, une expérience suffisante avec la manipulation de tissu digéré, l'identification correcte des parties de tissus spécifiques et de leurs lignes de dissection tout va contribuer au succès de l'isolement des cellules.

Figure 1.Dissection de tissu auriculaire. (A) Face à la partie antérieure du cœur, deux s chirurgicalesutures fixer l'aorte proximale à l'extrémité de la souche d'une canule 21 G en acier. (B) Vue vers les spectacles de base de coeur tissu pulmonaire obstruer la vue de la chambre auriculaire lors de la dissection restants. LA, oreillette gauche; RA, l'oreillette droite. (C) lungtissue restant et des gros vaisseaux ont été retirés pour accéder aux chambres auriculaires. Rempli triangle noir, artère pulmonaire; triangle strié, veines pulmonaires; rempli triangle blanc, la veine cave supérieure; triangle coffret, veine cave inférieure. (D) Tout d'abord, la paroi de l'oreillette droite est disséqué, tandis que les pinces tiennent l'appendice auriculaire. (E) Voir dans la cavité de l'oreillette droite. Le triangle noir marque le septum interauriculaire intact. (F) La dissection est poursuivie à pénétrer dans la cavité de l'oreillette gauche de la chambre. (G) Après dissection complète des oreillettes gauche et droite, les valves auriculo-ventriculaires deviennent visibles. Dispositif de soupape fibreux est disséquée et écartée pour SUBSEQuently récolter que le tissu musculaire ventriculaire. vue (H) postérieure des oreillettes isolées gauche et droite. LA, oreillette gauche; RA, barres de droite atrium.Scale: 700 um.

Pour déterminer la qualité d'isolation de la cellule, la figure 2 présente des exemples typiques de cellules lors de l'évaluation du rendement et de la viabilité de la tige ou en forme de myocytes intacts striés brique typique, à la fois pour la MA et les machines virtuelles. Peu endommagé, visuellement discret ainsi que des cellules anormales gravement endommagés avec des morphologies trop courbées, ou des cellules en forme de sphériques anormales, peuvent être facilement identifiés, notamment l'exclusion du bleu trypan comme décrit à la section 1.11. Bien que les myocytes restent intactes lumineux et homogène strié lorsqu'elles sont exposées à trypan bleu extracellulaire, les cellules endommagées présentent généralement plusieurs vésicules membranaires et / ou s'accumulent rapidement bleu trypan dommage indiquant de manière intracellulaire de la membrane. Toutefois, bleu trypan par lui-même peut endommager les cellules par le biais de unnecessariment longue période d'incubation et une évaluation immédiate de la qualité de la cellule est donc obligatoire. Des exemples de formes les plus évidentes de dommages cellulaires comme la contracture myofilament ou à l'intégrité de la cellule brut de dommages de surface compromettre sont présentés dans les figures 4C et 4D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 Trypan de coloration des cellules d'exclusion au bleu. Isolé (A) AM et cellules (B) VM sont mélangés en suspension avec du bleu trypan et visualisés par un microscope optique inversé montré à 40Xmagnification. Remarque thatabnormal cellules sphériques (A) et (B) en prenant en bleu trypan, qui indicatesmembrane leakage et des dommages structurels. En revanche, les cellules centralAM et VM avec membranes intactes excluent bleu trypan comme indiqué. En outre, notez que AM intact et cellules VM montrent des stries de sarcomériques au long de leur volume cellulaire, bulles de nomembrane et angles vifs, les deux côtés latéraux et les deux disques intercalés. Les barres d'échelle: 20 um.

Après le succès de rendements isolement, cellules de machines virtuelles à partir de 5 x ^{5 octobre} au ^{6 octobre} on peut s'attendre d'un seul digestion de cœur de souris. Le rendement en AMS est significativement plus faible dans l'ordre des cellules à l'exclusion des 3 x 10 ³ à 3 x 10 ⁴ en forme de tige, le bleu trypan. Contrairement à VM, AM isolements de temps en temps ne même entre des mains expérimentées. Étape 1.11 résume les procédures façon d'estimer le rendement des cellules saines isolés en suspension. En outre, de déterminer les dimensions de la cellule moyenne par étape 1.13 comme indiqué sur la Figure 3 AM individu ou isolats de cellules VM ou de comparer AM par rapport à des populations de cellules VM côté-à-côte (au besoin). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3.Bright analyse morphométrique domaine des myocytes cardiaques. L'contour VM a été détecté par les outils d'analyse d'images décrites à l'étape 1.13. Utilisez l'outil de sélection de polygone pour marquer visuellement et définir la frontière extracellulaire des cellules défini par la membrane de surface extérieure pour l'analyse. Annonce de la région sélectionnée d'intérêt (ROI) pour le gestionnaire de ROI suivie par des mesures de distance 1D. Pour les études comparatives de AM vs dimensions VM, il est utile de documenter la longueur de la cellule, la largeur et la région, et de calculer la longueur: largeur.

nt "> Pour fluorescence membranes tache de TATS soit dans les cellules AM ou VM, le colorant membranaire intégrale di-8-ANEPPS est utilisé comme décrit dans la section 2, suivi par microscopie confocale, qui a donné lieu à des images représentatives de réseaux de TATS représentées dans les figures 4A et 4B. De plus, la figure 4A montre l'image lumineuse correspondant transmis d'une AM intacte côte-à-côte avec l'image de TATS confocale (pour l'acquisition d'image voir section 3). Comme décrit par étape 1.12, l'intégrité de la membrane morphologique et la surface de la vie myocytes est jugé par l'intermédiaire des images de lumière transmise. La région amplifiée du signal di-8-ANEPPS met en évidence la morphologie sous-jacente du réseau TATS en MA, caractérisé par axiales abondante (longitudinaux) de tubes à membrane. En revanche, la morphologie TATS de santé des machines virtuelles comme le montre la figure 4B est caractérisé par un nombre à peu près équivalente d'un axialed composantes transversales. En revanche, les figures 4C et 4D montrent des exemples de myocytes cardiaques endommagés qui doivent être exclus de l'analyse. En particulier, la cellule AM sur la figure 4C est contracté en évidence par une longueur de sarcomère anormalement court de 1,2 um et un réseau irrégulier, déformé TATS tandis que la cellule VM sur la figure 4D présente de multiples vésicules membranaires (environ marquée par des triangles rouges) indiquant les perturbations de la membrane , qui peut se produire à la membrane de surface extérieure, mais aussi au niveau des membranes de TATS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4.Live coloration de membrane auriculaire et ventriculaire intact myocytes. correspondants s'allument et images confocales de vie transmis di-8-ANEPPS teinté intact (A) et AM (cellules B) VM. En revanche, une heure et partiellement contracté potentiellement endommagé ayant une longueur de sarcomère de 1,2 um est représentée en (C). Myocytes contractés généralement montrent anormalement raccourcis et les structures de TATS déformées, donc exclus de l'analyse. Un autre indicateur important pour les défauts de la membrane cellulaire sont des vésicules membranaires (triangles rouges), comme indiqué dans une machine virtuelle dans (D). Bulles membranaires représentent des structures de la membrane de surface endommagés et les cellules avec des bulles doivent être exclus de l'analyse de TATS. En outre, la machine virtuelle présente des dommages brut absence apparente toute une partie de sa partie inférieure gauche (marqué d'un astérisque). En résumé, en comparant la lumière transmise et images confocales, les cellules morphologie et intégrité de surface est documenté et combinées avec des informations de signal fluorescent. Marques 'N' nuCLEI omis de l'analyse de la tache TATS membrane. Les barres jaunes indiquent amplifiées ROI de la même image confocale présenté ci-dessus. Les barres d'échelle:. 10 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Images confocales de membranes TATS avec un rapport suffisant signal-sur-bruit, comme illustré sur les figures 4A et 4B sont acceptées pour une analyse quantitative. L'analyse de la membrane TATS est basée sur des données dérivées de squelettisées des composantes de signal fluorescent rectilignes. Figure 5 montre le diagramme de flux de travail de chacune des étapes de traitement d'image qui sont décrits en détail par les étapes 4.3 à 4.5. Ces étapes produisent des images squelettisées représentant TATS rectilignes réseaux membrane comme indiqué pour chaque VM isolée (figure 5A) et AM cellules (Figure 5B).

Figure 5.Workflow pour squelettisation d'images de TATS fluorescentes. Étapes de traitement d'image qui conduisent à une image squelette du réseau TATS sont représentés par différents exemples étape par étape l'image à la fois pour une di-8-ANEPPS colorées VM (A) et AM (B). Pour l'étape individuelle de traitement d'image, s'il vous plaît se référer au chapitre 4. Noter les différences dans les barres d'échelle:. 20 pm (A) et 10 microns (B) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Une étape essentielle lors du traitement d'image, de déterminer le seuil approprié pour la binarisation des données comme décrit dans la section 4.5.6. L'image binaire résultant ne doit inclure que les vrais signaux de la membrane du réseau TATS mais pas de fausses structures dérivées par seuillage erronée du bruit du signal de fond. Pourtant, il est important que le seuil est assez bas pour détecter tous les vrais structures de TATS tels que les véritables composants de TATS ne sont pas à tort perdu lors de l'analyse d'image. Figure 6 illustre la marche à suivre pour sélectionner le seuil pendant binarisation des données. Bien que d'un seuil de 40, comme le montrent les figures 6B et 6C semble approprié pour détecter tous les vrais structures de TATS individuellement, le choix d'un seuil plus élevé, par exemple, de 60, comme le montre la figure 6A ne détecte pas les structures de la membrane plus faible axiales (ATS) comme indiqué par des triangles jaunes . En revanche, le choix d'un seuil inférieur, par exemple, de 20, comme le montre la figure 6D conduit à une détection erronée de bruit de fond en tant que structures de TATS faux-positifs, comme indiqué partriangles jaunes.

Figure 6.How pour déterminer le seuil de signal au cours de squelettisation TATS données d'image. Ces exemples montrent squelettes TATS chaque générées pour différents seuils de binarisation en données décrites dans l'étape (4.5). Images supérieures montrent: les ajustements de seuil en utilisant Fidji. Les images à basse: superposition d'images décharnées avec l'image de fluorescence d'entrée correspondant et les régions agrandies comme indiqué. Un seuil par exemple élevé, 60 appliquée dans (A) n'est apparemment pas approprié pour détecter tous les vrais structures de TATS comme indiqué par des triangles jaunes dans la section agrandie. Un seuil de 40 appliqué dans (B) et (C) détecte les structures TATS correctement et ne détecte pas le bruit de fond, alors que par exemple un seuil bas., 20 (D) identifie à tort le bruit de fond que les structures de TATS et produit des signaux faux positifs de structures membranaires non-existants ainsi. Signaux faux positifs sont indiqués par des triangles jaunes dans l'encart agrandie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le "Analyser Skeleton (2D / 3D)" plug-in prend en charge l'analyse détaillée des structures de TATS décharnées. Une fois exécuté, le plugin de produire un tableau de données avec les paramètres suivants du squelette: #branches, #junctions, # point final voxels, la durée moyenne de la branche, les points #triple, les points #quadruple, et la longueur maximale de la branche. Pour une description détaillée de tous les paramètres de sortie s'il vous plaît se référer à http: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton et articles connexes ^29-31. Une sortie typique de la table de données est représenté sur la figure 7A.

La longueur totale du squelette par un retour sur investissement:

Σ (#branches x longueur de la branche moyenne) = 5155 px = 515,5 pm

La longueur totale du squelette peuvent être normalisées par rapport à la zone d'image. Pour l'exemple représenté sur la figure 7, la longueur normalisée de squelette de 0.64μm / um ² et la somme de toutes les jonctions sont calculés comme indiqué ci-dessous:

Longueur normalisée de squelette:

515,5 um / 803,6 um ² = 0,64 um / um ²

Nombre normalisé de jonctions:

155 jonctions 803,6 um / ² 2 pm

Figure sortie de données 7.Automated à partir d'images décharnées. (A) Un tableur type de données généré par le «Analyser Skeleton (2D / 3D) 'plug-in de l'image squelette montré dans (B). Pour une description détaillée des paramètres de sortie possibles s'il vous plaît se référer à http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton . S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les étapes de traitement d'image décrits à la rubrique 4.5 et illustrés à la figure 5 peuvent être automatisées à l'aide d'une macro Fidji fourni comme code supplémentaire Fichier 4.3 et 4.4. La macro peut être avantageux pour l'analyse des groupes d'ensembles de données complets, par exemple en préparant individuels des piles d'images d'entrée pour chaque groupe de traitement indépendant pour analyse automatisée en utilisant les macro-commandes.

La stratégie du logiciel décrit permet en outre à l'analyse de l'orientation du réseau TATS pour tous les composants. Pour cela, utilisez la "directionnalité" plugin (http://fiji.sc/Directionality) ^29,31 qui produit des données de l'histogramme montre la distribution de l'orientation de tous les TATS des orientations composants. Si l'axe des x de l'image d'entrée correspond à l'axe principal d'une cellule AM ou VM donné, la axial (longitudinaux) des composants de TATS sera représentée par le bac de 0 °, que les éléments transversaux sont représentés par la 90 &# 176; bin. Figure 8 montre la directivité exemplaire des histogrammes à partir d'images TATS squelettisées pour une VM (8A) par rapport à un AM (8B) cellule. Bien que l'histogramme de la directivité d'une machine virtuelle typique présente une distribution double crête à 0 ° et 90 °, l'histogramme h montre un seul pic dominant à 0 °. Ces exemples sont en accord avec les observations antérieures que les composants individuels de TATS machines virtuelles sont presque également répartis entre les tubules T et A-tubules, alors que les composants de TATS AMS peuvent être principalement composé d'un tubules.

Figure 8.Representative directionnalité histogramme de TATS réseaux de cellules individuelles. Histogrammes de directivité ont été générées à partir d'images de VM squelettisées individuel (A) par rapport à AM (B S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

tampon de perfusion	mM
NaCl	120,4
KCl	14,7
KH ₂ PO ₄	0,6
Na ₂ HPO ₄	0,6
_MgSO4	1.2
HEPES	10
NaHCO ₃	4.6
Taurine	30
2,3-butanedione monoxime	10
Glucose	5.5
pH 7,4
un tampon de digestion	mM (si non spécifié)
NaCl	120,4
KCl	14,7
KH ₂ PO ₄	0,6
Na ₂ HPO ₄	0,6
_MgSO4	1.2
HEPES	10
NaHCO ₃	4.6
Taurine	30
2,3-butanedione monoxime	10
Glucose	5.5
collagénase de type II	600 U / ml
pH 7,4
Tampon d'arrêt	mM (si non spécifié)
NaCl	120,4
KCl	14,7
KH ₂ PO ₄	0,6
Na ₂ HPO ₄	0,6
_MgSO4	1.2
HEPES	10
NaHCO ₃	4.6
Taurine	30
2,3-butanedione monoxime	10
Glucose	5.5
_CaCl2	0,0125
de sérum de veau bovin	10%
pH 7,4

Tableau 1.Buffer solutions. Le contenu de trois solutions tampons physiologiques différentes pour l'isolement cellulaire et l'imagerie sont résumées.

Discussion

Bien que les myocytes cardiaques ont été isolés et étudiés depuis des décennies ^32, une étude récente a conclu que les isolements cellulaires des myocytes cohérentes de haute qualité reste difficile ^27. Cela reflète protocoles relativement complexes pour l'isolement des myocytes cardiaques primaires vis-à-vis d'un manque d'approches standards communs, des métadonnées partagées, et une documentation claire de la qualité de la cellule. protocoles d'isolement cellulaire sont généralement personnalisés par des groupes individuels, produire des résultats variables de cellule isole, dépendra de paramètres de modèles individuels (par exemple, les espèces, l'âge, troubles cardiaques) coexistent, et sont généralement ajustées pour des conditions expérimentales particulières. Dans le cadre de la TATS quantitative des études et des protocoles membrane présentés ici, un niveau essentiel de l'évaluation et de la documentation qualité concerne l'confocale ou la super-microscope des différents structures de la membrane cellulaire sujettes à métaboliques et protocole d'isolement des changements à charge, à la foisAM ou VM. Il est important, même si les rendements élevés de souches cellulaires suggèrent myocytes intacts en bonne santé, les chercheurs doivent documenter et un jugement critique sur chaque cellule individuelle avec soin en fonction de critères morphologiques de surface et TATS intégrité de la membrane contre les dommages non-spécifique en raison de procédures d'isolement et les variations spécifiques en raison de différents types des interventions par rapport aux conditions de contrôle. Une variable importante lors de l'isolement cellulaire cardiaque est l'activité spécifique d'un lot de collagénase donné. Pour sélectionner un nouveau lot de collagénase, l'activité enzymatique de la collagénase plusieurs échantillons doit être testé contre l'autre par l'évaluation de rendement des myocytes cardiaques et de qualité, et selon les instructions du fabricant. Idéalement, un nouveau lot de collagénase est identifié avec l'activité de la collagénase semblable à beaucoup utilisés avec succès précédents (pour l'évaluation approfondie des activités possibles de l'enzyme de se référer à l '«outil de sélection collagénase beaucoup" dans le matériel et les méthodes tableau). TAken ensemble, les approches quantitatives de tatouages visualisation de la membrane dépendent de façon critique sur la qualité de l'isolement cellulaire et, vice versa, isolements cellulaires cardiaques conduisant à une dégradation de la membrane non spécifique tel que documenté par TATS microscopie devrait déclencher un examen critique et la correction des procédures d'isolement. Comme la qualité de l'isolement cellulaire et TATS visualisation de la membrane et la quantification sont intrinsèquement liés, les protocoles mentionnés dans cet article couvrent tous les aspects importants comme une stratégie continue.

Un défi supplémentaire et problème commun des études cardiaques, des dommages aux cellules et / ou la perte de cellules sont dues à des interventions compromettantes métaboliquement par exemple, après un infarctus du myocarde ^9, mais doivent être jugés par rapport au potentiel par inadvertance des dommages, par exemple, à la suite d'embolie gazeuse inaperçu lors de l'isolement cellulaire. Isolation des myocytes cardiaques de coeurs malades peut conduire à plus, la perte de cellules importante et une diminution des rendements de cellules. Par conséquent, comparison du nombre total de cellules intactes isolées entre le contrôle et les cœurs malades peut être utile si l'isolement cellulaire et comptage sont appliquées de façon uniforme à travers des protocoles standardisés. Par conséquent, il est essentiel pour juger de l'intégrité de la cellule par l'intermédiaire d'un groupe témoin approprié, ce qui reflète le mieux la qualité de l'isolement des cellules possible des myocytes. Fait important, la qualité de la cellule individuelle et la microscopie de cellules vivantes en bonne santé par rapport à des malades en fonction des myocytes endommagés par inadvertance par la procédure d'isolement peuvent influencer de manière significative l'analyse des réseaux TATS membranaires. Les protocoles présentés ici soulignent donc l'intégrité et la stabilité des composantes physiologiques de la membrane lors de l'isolement cellulaire et microscopie de cellules vivantes de membranes intactes. L'ensemble du flux de travail est conçu comme une stratégie continue pour atteindre et conserver intacts les composants de la membrane TATS tout en excluant les cellules endommagées, car ceux-ci présentent l'isolement de la membrane à charge objets tels que tubes de membranes rompues, membranbulles e, et des réseaux de TATS modifiées à tort dans des conditions de contrôle et de compromettre une analyse plus quantitative. Vice versa, les mêmes stratégies sont essentielles pour les études d'intervention avec la possibilité de rompre les membranes TATS, qui dépendent de façon critique sur les contrôles de comparaison significatifs entre vrai sain par rapport à vrai cellule malade avec TATS modifications de la membrane.

En outre, nous abordons les procédures pour obtenir l'isolement techniquement beaucoup plus difficile de cellules AM. Malgré les progrès et l'amélioration des protocoles, il est important de souligner qu'il n'est pas anodin de reproduire isolement de cellules de haute qualité de machines virtuelles et encore moins fiables pour AM. Cela est dû au rendement global plus faible de cellules AM où même de petites erreurs ou des variations au cours de l'isolement des cellules peut conduire à un échec de l'isolement des cellules AM, tandis qu'un faible degré de VM dommages cellulaires pourrait être moins visible dans la suspension de cellules en raison de relativement grande cellule nombres comparés à AM. Comme les cellules AM pourraient devenir curved après l'isolement, l'analyse par plusieurs ROI peut être avantageux, comme indiqué dans l'étape 4.3. Suite à une procédure détaillée d'étapes d'isolement cellulaire, nous fournissons un protocole pour la coloration directe intégrale de la membrane et confocale ou STED superrésolution imagerie de tatouages réseaux à la fois pour les machines virtuelles et AM. Ces protocoles permettent à la fois une analyse quantitative et de la différenciation de certaines composantes des membranes TATS par les paramètres précédemment établis. Par rapport à des machines virtuelles, l'organisation 3D et les comportements fonctionnels du réseau TATS auriculaire dans MA sont actuellement moins bien compris.

Les procédures à l'image de membranes TATS dans les cellules vivantes (étapes 3.1 à 3.7) ont été développés avec confocale commerciale (Table des Matières / Équipement) et STED fluorescence microscopes sur-mesure ^9. Pour optimiser les réglages du microscope pour la production d'image fluorescente et l'analyse quantitative de TATS, les points suivants sont d'une importance générale:

Objectif Afin de résoudre les petits détails de tatouages structures membranaires, tester empiriquement dont l'objectif fournit la meilleure qualité d'image tout en se concentrant plusieurs micromètres de profondeur dans la cellule. Certains microscopes confocaux peut obtenir de meilleurs résultats avec les objectifs de l'eau ou du glycérol, à la différence de l'objectif de l'huile 63X 1,4 NA utilisé ici. Objectifs avec grossissement 100X sont utilisés pour la super-STED microscopie, troquer un champ de vision plus petit pour une résolution nanométrique ^34.
Excitation et le gain
Les paramètres optimaux de la puissance d'excitation et le gain du détecteur dépend de la voie optique du microscope, les performances du laser, et des propriétés d'échantillons. Idéalement, la puissance du laser et le gain sont réglés à exploiter la gamme complète du détecteur, tout en évitant de saturation de l'image. Logiciels de microscopie commerciales fournissent des tables de consultation qui visualisent la limite inférieure et supérieure de la plage dynamique. En outre, afin de minimiser blanchiment du colorant emploient le plus bas possible lpuissance aser qui fournit encore structurelles détails de la membrane TATS suffisantes. En outre, la puissance d'excitation doit être suffisamment faible pour éviter des dommages photo cumulatif entraînant une contracture des myocytes et la mort.
Taille des pixels
Utilisez une taille de pixel compatible avec échantillonnage de Nyquist, environ la moitié de la résolution obtenue avec les paramètres donnés. Pour l'imagerie confocale d'une taille de pixel de 100 nm x 100 nm est compatible, ce qui limite également le blanchiment. Pour la microscopie super-résolution des tailles de pixels significativement plus petits sont utilisés, par exemple, 20 nm x 20 nm pour la microscopie STED ^9.
Temps de passage
Microscopes confocaux assurent une fonction de moyennage. En général, utiliser le plus possible le temps de séjour de pixels pour éviter le blanchiment en combinaison avec la moyenne des signaux, par exemple, ligne moyenne ≥ 8 pour améliorer le rapport signal sur bruit à l'autre.
Documenter les paramètres de microscopie appliquée à travers méta-données
Une fois les réglages commentdétails de l'image de structures membranaires TATS ont été optimisés sur un microscope confocal particulier, coffre-fort et / ou documenter les paramètres (protocole de méta-données). Obtenir toutes les images dans un groupe (s) (ou entre) des cellules avec le même objectif, la puissance d'excitation, le gain, la taille de pixel, pixel temps de séjour, et de la fonction moyenne. L'égalité des conditions d'imagerie permettent une comparaison directe et la quantification dans un groupe (s) (ou entre) des cellules.
Pour une orientation générale et de plus amples détails sur les principes et applications de la microscopie confocale référer au Guide de biologique microscopie confocale (Pawley JB, 3 ^e édition, 2006, Springer Science + Business Media, LLC).

Contrairement aux stratégies d'analyse directs présentés ici, les publications antérieures décrivant les membranes les habitats et les changements liés à la maladie, ont utilisé lectures d'agrégats régionaux de densité T-tubule comme stratégie quantitative ^16,17, ou des stratégies régionales indirectes basées sur des transf Fourieranalyse ormation de signaux membranaires striés afin d'évaluer T-tubule composant la régularité ^7. En revanche, les approches quantitatives décrites ici sont directement liés à des composants individuels de TATS et fournissent un certain nombre de paramètres supplémentaires, y compris la membrane des propriétés du réseau et des composants spécifiques comme le pourcentage de A-tubules. En outre, la densité du réseau TATS peut être quantifiée comme la longueur normalisée de l'ensemble du squelette extrait par zone ROI. Le nombre de jonctions triples de trois individus, les composants tubulaires reliés en continu peut être utilisé comme une mesure de la complexité du réseau de branchement de la membrane TATS. Nous notons que l'analyse de plus petits composants de TATS dépend des procédures de coloration. Dans notre expérience, 800 pi d'une solution de di-8-ANEPPS 50 uM sont suffisantes pour colorer les réseaux de TATS complets dans un culot cellulaire contenant 50 000 cellules VM ^9. Cependant, si le culot de cellules contient un nombre inférieur de myocytes cardiaques, Si puissants détecteurs de fluorescence sont disponibles, et si l'imagerie confocale de la distribution globale du réseau de TATS plutôt que les plus petits détails de la membrane et les changements quantitatifs sont intéressants, les concentrations de colorant inférieures peut être utilisé sur la base de tests empiriques. Enfin, un macro d'un logiciel écrit pour l'analyse décrite peut être utilisée pour automatiser les étapes de traitement d'image pour faciliter l'analyse de grandes séries de données, ce qui est particulièrement utile pour la comparaison entre les différents groupes de traitement (par exemple, médicaments), des types de cellules (par exemple, AM par rapport à VM ), et interventions physiopathologiques (par exemple, imposture contre l'infarctus du myocarde).

Pour l'analyse de l'image des réseaux de TATS, la séquence des étapes principales suivantes sont appliquées: 1) bal soustraction de fond (4.5.1) pour éliminer les variations spatiales de l'intensité d'arrière-plan; 2) contraste local amélioration (4.5.2).; 3) lissage de l'image (4.5.3); 4) région statistique fusion (4.5.4); 5) définissant leseuil de binarisation (4.5.6); et 6) le calcul des données de skeleton (4.5.8). Une étape critique au cours de la squelettisation des images TATS fluorescent est la binarisation de l'image représentée sur la figure 6. Les étapes de seuillage associés définissent en fin de compte que les vrais structures membranaires sont détectées pour représenter les composants de TATS sous-jacentes par rapport potentiellement fausses structures identifiées par erreur de bruit de fond. Identification du seuil correct pour l'analyse d'image binaire doit correspondre aux véritables TATS structures membranaires, qui dépend d'un (SNR) rapport suffisamment élevé signal-sur-bruit pour chacun des approches de microscopie confocale et SuperResolution. Par conséquent, une qualité d'image suffisante devrait être établi d'abord et ensuite combiné à une analyse critique de la qualité de la cellule individuelle, y compris la documentation par des images de champ lumineux comme indiqué. D'autres options pour adapter le protocole de segmentation d'image pour une sortie de données de microscope donné et / ou physsiologiques des questions comprennent la déconvolution d'images et d'autres procédures de seuillage comme "Otsu» ou «Iso-données" disponibles sous forme de plugins ImageJ. Quelle que soit la procédure de segmentation finale, on considère la comparaison entre les premières données extraites, et par superposition d'image d'une étape de contrôle de la qualité obligatoire. En résumé, l'intégrité morphologique et membrane de myocytes isolés individuels, une coloration suffisante des membranes TATS intracellulaires, l'optimisation des paramètres pour l'imagerie de fluorescence, et le contrôle superposition de données de squelette extraites seront tous contribuer à la qualité des images TATS fluorescents et des résultats quantitatifs.

Si les grandes espèces que la souris sont utilisés pour l'isolement cellulaire, les protocoles peuvent être facilement adaptées le cas échéant. Pour les prochaines grandes espèces, des coeurs de rats peuvent être une canule avec un instrument contondant 14 G canule (diamètre extérieur 2,1 mm) et perfusés à 8 ml / min. Significativement coeurs âgés ou malades peuvent nécessiter encore plus canule tailles. Dans gèneral, la perfusion cardiaque peut être effectué soit par une pression constante, par exemple, en utilisant une colonne d'eau élevée de 1 m entre le réservoir et l'aorte ou de débit constant à l'aide d'une pompe péristaltique. Pour l'isolement de cellules à partir de petits cœurs de rongeurs tels que les souris et les rats débit constant peut être avantageux car digestion à la collagénase sera éventuellement perturber vaisseaux de résistance coronaire conduisant à des taux de perfusion excessifs de fuite des lits des vaisseaux qui vont être contrôlés dans une certaine mesure par des protocoles de débit constant. En revanche, la perfusion à pression constante est avantageux que la surveillance du débit et de corriger la canulation est une priorité, ce qui est avantageux pour les modèles d'intervention avec des comportements de résistance du vaisseau sanguin altéré ainsi que pour la formation des procédures d'isolement des cellules.

Comme indiqué ci-dessus, la qualité de la cellule suffisant est très importante pour les études quantitatives de systèmes de membranes endogènes. Cependant, au cours de la perfusion cardiaque et digestion à la collagénase de nombreux facteurs peuvent critically affectent la qualité de l'isolement cellulaire, qui ne doit jamais être sous-estimée lors de l'optimisation de protocole ou de dépannage ^27. En particulier, l'activité de la collagénase d'un lot donné doit être déterminé pour le tissu d'intérêt spécifique, par exemple, les oreillettes ou les ventricules, avant l'exécution des études expérimentales de bonne foi à établir des conditions d'isolement doit être maintenue tout au long du reste de l'étude. En outre, la qualité de l'eau, le pH, la température, l'optimisation et le nettoyage de l'installation de perfusion permettra de minimiser le risque de dommages par inadvertance des contaminants et des embolies et les facteurs potentiellement supplémentaires doivent être surveillés pour établir les conditions optimales d'homéostasie pendant l'isolement cellulaire. BDM (2,3-butanedione-monoxime) un inhibiteur réversible de la myosine ATPase ponts transversaux est généralement utilisé au cours de la dissection des tissus et de la digestion pour maintenir la relaxation musculaire cardiaque, ce qui augmente le rendement de l'isolement des cellules. Néanmoins, les chercheurs doivent to être conscient que BDM peut exercer les activités de la phosphatase non spécifiques entraînant des effets hors-cible par exemple, l'inhibition de la Na ⁺ / Ca ^{2 +} courants d'échange sous certaines conditions ^33. Pour certaines expériences, il pourrait être avantageux de remplacer par BDM blebbistatin comme solution cardioplégique, un inhibiteur ayant une forte affinité pour la myosine à des concentrations micromolaires qui est toutefois relativement coûteux et toxique et peut avoir d'autres effets hors cible. Repos cardiomyocytes sains ne doivent pas présenter de contractions en l'absence de stimulation électrique et ces cellules doivent être exclus de l'analyse. D'autre part, cardiaque contraction des myocytes et de détente en réponse à une stimulation électrique à physiologiques extracellulaires concentrations de ^{Ca2 +} peut être utilisé pour établir le comportement contractile normale comme une mesure supplémentaire pour évaluer la qualité de la cellule fonctionnelle et / ou un comportement anormal dans la maladie cardiaque par rapport au témoin sain cellules.

9 et AM cellules ²¹ ainsi que pour l'analyse quantitative des réseaux de microtubules dans myocytes cardiaques fixes (données non présentées). Ces futurs et les applications de protocoles peuvent ouvrir des pistes pour une variété de questions expérimentales telles que la caractérisation des membranes TATS à différents stades de développement ou l'analyse de la membrane associée protéines ou organites structures qui entrent en contact avec le réseau de TATS d'exercer très localisés, la signalisation de domaine spécifique fonctionne dans les cellules AM et VM.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and Enzymes
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	B0753
Bovine calf serum	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	SH30073	Triple 0.1 µm sterile filtered.
CaCl₂	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	21115	Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl₂stock concentration.
Collagenase type II	Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany	on request	Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.
Glucose	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	HN06.1
Heparin	Rotexmedica, Trittau, Germany	PZN-03862340	Diluted in 0.9% NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	9105.4
Forene 100% (V/V)	Abbott, Libertyville, IL, USA	B506	Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.
KCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6781.3
KH₂PO₄	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3904.2
Laminin (2 mg/ml)	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	354232	Lamination is described under step 2.1.
MgCl₂·6H₂O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2189.2
MgSO₄·7H₂O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8283.2
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4984.2
NaHCO₃	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	HN01.1
Taurin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4721.2
Dyes
Di-8-ANEPPS	Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany	D-3167	Stock solution 2 mM in DMSO
Trypan blue	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	T8154	Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.
Langendorff Perfusion Setup
Circulation thermostat	Lauda, Lauda-Königshofen, Germany		Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use.
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump	VWR, Darmstadt, Germany	224-2252	Tubing needs to be changed regularly.
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat	VWR, Darmstadt, Germany	228-4340
Heating coil surroundung perfusion tubing	Rettberg, Göttingen, Germany	custom-made	Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight.
Peristaltic pump	Ismatec, Wertheim, Germany	ISM830
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm	Braun, Melsungen, Switzerland	16500C
Three way stop cock Discofix 3SC	Braun, Melsungen, Switzerland	4095146
Instruments
42 mm glass coverslips	Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany	on request	0.13-0.16 mm thickness
Cannula 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA	304432	Cut to a length of ~5 mm, roughened with sandpaper.
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm	Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany	on request	0.38-0.42 mm thickness
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11151-10
LSM 710 NLO	Carl Zeiss, Jena, Germany		63X 1.4 NA oil objective
Neubauer improved cytometer	Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany	1100000	Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10-20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dilutions and counting shortcuts.
POC-R2 Imaging Chamber	Pecon, Erbach, Germany		Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~1,000 AM and ~10,000 VM
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	15025-10
Student dumont #7 forceps, inox	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91197-00
Student iris scissors, curved, 11.5 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91461-11
Student iris scissors, straight, 11.5 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91460-11
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91402-12
Tissue forceps, 1 x 2 teeth, slim, 10 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11023-10