Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi
Summary
Vi presentiamo un mouse fetale sistema di coltura in vitro eritroblasto fegato che analizza le fasi precoce e tardiva dell'eritropoiesi terminale. Questo sistema facilita l'analisi funzionale di geni specifici in diversi stadi di sviluppo.
Abstract
Eritropoiesi comporta un processo dinamico che inizia con unità formanti impegnata a raffica eritroide (BFU-Es), seguita da rapida divisione eritroide unità formanti colonia (CFU-E). Dopo CFU-Es, le cellule sono morfologicamente riconoscibili e generalmente chiamato eritroblasti terminali. Una delle sfide per lo studio dell'eritropoiesi terminale è la mancanza di approcci sperimentali per analizzare le funzioni del gene in modo cronologico. In questo protocollo, si descrive una strategia unica per determinare le funzioni del gene nelle prime e ultime fasi dell'eritropoiesi terminale. In questo sistema, il mouse TER119 fegato fetale (marker delle cellule eritroidi mature) eritroblasti negativi sono stati purificati e trasdotto con espressione esogena di cDNA o piccoli RNA hairpin (shRNAs) per i geni di interesse. Le cellule sono state poi coltivate in terreno contenente fattori di crescita diversi eritropoietina (Epo) per mantenere la loro fase progenitore per 12 ore, consentendo cDNA esogeni o shRNAsdi esprimere. Le cellule sono state modificate per Epo media dopo 12 ore di indurre il differenziamento e la proliferazione cellulare, mentre il materiale genetico esogeno erano già espressi. Questo protocollo facilita l'analisi delle funzioni dei geni nella fase iniziale dell'eritropoiesi terminale. Per studiare terminale eritropoiesi fase tardiva, le cellule sono state coltivate in Epo immediatamente medio dopo trasduzione. In questo modo, le cellule sono state già differenziate per la fase tardiva dell'eritropoiesi terminale quando sono stati espressi i materiali genetici trasdotte. Si consiglia una applicazione generale di questa strategia che potrebbe aiutare a capire le funzioni del gene dettagliate in diverse fasi della eritropoiesi terminale.
Introduction
L'eritropoiesi è il processo di differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche multipotenti a maturare eritrociti. Questo processo graduale prevede la formazione di unità formanti impegnata a raffica eritroide (BFU-Es), le unità formanti colonia in rapida divisione eritroidi (CFU-Es), e morfologicamente riconoscibili eritroblasti 1,2. Eritropoiesi Terminal da cellule progenitrici CFU-E coinvolge sequenziale eritropoietina-dipendente e fasi indipendenti 2,3. Nella fase iniziale dell'eritropoiesi terminale, eritropoietina (Epo) si lega al suo recettore sulla superficie cellulare e induce una serie di vie di segnalazione a valle che impediscono l'apoptosi delle cellule e promuovono divisioni cellulari rapidi e l'espressione genica 1,4. Nella fase tardiva dell'eritropoiesi terminale, eritroblasti subiscono uscita cellula terminale del ciclo, cromatina e di nuclei di condensazione, e l'estrusione dei nuclei altamente condensati 5.
La nostra comprensione di terminaleeritropoiesi ha notevolmente migliorato negli ultimi decenni, che è in gran parte dovuto il successo nell'uso di diversi in vitro e de modelli in vivo di topo 6-9. Tra questi modelli, la coltura in vitro di topo fetale eritroblasti fegato fornisce molti vantaggi tra cui la facilità di purificazione delle cellule, la proliferazione e la differenziazione veloce, e una mimica più vicino a eritropoiesi umana 10,11. In questo sistema, un gran numero di cellule progenitrici eritroidi da topo fegati fetali possono essere facilmente isolate dalla purificazione singolo passo di TER119 (un marcatore per le cellule eritroidi mature) eritroblasti negativi. Durante la cultura di due giorni degli eritroblasti, la differenziazione di queste cellule può essere monitorato da un citometria a flusso basato sulla superficie espressione del recettore della transferrina (CD71) e la TER119 dell'antigene 12. Inoltre, l'enucleazione dei eritroblasti differenziazione terminale può essere rilevata da un produttore di DNA (Hoechst 33342) 13. Inoltre, i progenitori purificati possono essere geneticamente modificati espressione esogena di cDNA o piccoli RNA hairpin (shRNAs) per i geni di interesse, che facilita gli studi meccanicistici delle funzioni di espressione genica su eritropoiesi 11,13,14.
D'altra parte, il tasso di crescita delle cellule veloce può essere una lama a doppio taglio poiché è difficile caratterizzare funzioni geniche nelle diverse fasi di eritropoiesi terminale. Nella maggior parte dei casi, è difficile stabilire se una specifica funzioni del gene nella fase iniziale dell'eritropoiesi terminale fin dal momento in cui il cDNA o shRNAs espresso, le cellule già superato la fase iniziale. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un sistema unico di sezionare prime e ultime fasi dell'eritropoiesi terminale. Per la fase iniziale di eritropoiesi terminale, geneticamente modificati TER119 eritroblasti negative sono state coltivate in terreno Epo-libero ma contenente fattore delle cellule staminali (SCF), IL-6 e FLT3ligando di mantenere il loro status progenitore e consentire i cDNA trasdotte o shRNA all'espressione 13. Le cellule sono state modificate per Epo contenente medio dopo 12 ore per indurre la proliferazione e differenziazione cellulare. In questo modo, quando le cellule hanno cominciato a differenziarsi, i cDNA trasdotte o shRNAs erano già espressi. Per la fase tardiva dell'eritropoiesi terminale, TER119 eritroblasti negative sono state coltivate in terreno contenente Epo subito dopo la trasduzione. Pertanto, si può analizzare le funzioni dei geni di interesse nella fase tardiva della eritropoiesi terminale. In sintesi, una vasta applicazione di questo sistema aiuterebbe funzioni geniche sezionare in diverse fasi della eritropoiesi terminale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui vi presentiamo un sistema unico per analizzare cronologicamente topo fetale eritropoiesi terminale del fegato. Attraverso l'applicazione di diverse condizioni di coltura, abbiamo sezionato con successo l'eritropoiesi terminale in fase precoce e tardiva. Ciò è particolarmente importante per determinare i meccanismi di geni con funzioni multiple. Ad esempio, GTPasi Rac svolgono un ruolo importante in diverse fasi della eritropoiesi terminale. Inibizione della Rac GTPasi nella fase iniziale della differenziaz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da NIH R00HL102154, e un American Society of Hematology premio studioso P Ji.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
| holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
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