Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese
Summary
Nós apresentamos um rato fetal sistema de cultura in vitro de eritroblastos fígado que disseca os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Este sistema facilita a análise funcional de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento.
Abstract
Eritropoiese envolve um processo dinâmico que começa com unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES) seguido de divisão rápida erythroid unidades formadoras de colônia (UFC-Es). Depois de CFU-Es, as células são morfologicamente reconhecíveis e geralmente denominado eritroblastos terminais. Um dos desafios para o estudo da eritropoiese terminal é a falta de abordagens experimentais para dissecar as funções dos genes de uma forma cronológica. Neste protocolo, descrevemos uma estratégia única para determinar as funções dos genes nas fases precoces e tardias da eritropoiese terminal. Neste sistema, rato fetal Ter119 fígado (marcador de células eritróides maduras) eritroblastos negativos foram purificados e transduzidas com expressão exógena de cDNAs ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse. As células foram posteriormente cultivadas em outras que a eritropoietina (Epo) para manter a sua fase progenitoras, durante 12 horas, permitindo que os cDNAs exógenos ou shRNAs um meio contendo factores de crescimentopara expressar. As células foram mudadas para meio de EPO depois de 12 horas para induzir a diferenciação e proliferação celular, enquanto os materiais genéticos exógenos, já foram expressos. Este protocolo facilita a análise de funções de genes na fase inicial da eritropoiese terminal. Para estudar tarde fase terminal eritropoiese, as células foram cultivadas em meio imediatamente após a transdução de Epo. Desta forma, as células já foram diferenciadas para a fase tardia da eritropoiese terminal quando os materiais genéticos transduzidas foram expressos. Recomendamos a aplicação geral desta estratégia que ajudaria a entender as funções dos genes detalhadas em diferentes estágios de eritropoiese terminal.
Introduction
Eritropoiese é o processo de diferenciação de células-tronco hematopoiéticas multipotentes para amadurecer eritrócitos. Este processo gradual inclui a formação de unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES), os que se dividem rapidamente unidades formadoras de colônias eritróides (UFC-ES), e morfologicamente eritroblastos reconhecíveis 1,2. Eritropoiese Terminal a partir de células progenitoras CFU-E envolve sequencial estágios independentes 2,3-dependente e eritropoietina. Na fase inicial da eritropoiese terminal, eritropoietina (Epo) se liga ao seu receptor na superfície da célula e induz uma série de vias de sinalização a jusante que previnem a apoptose celular e promovem a divisão celular rápida e de 1,4 a expressão do gene. No final da fase de eritropoiese terminal, eritroblastos submeter saída do terminal ciclo celular, condensação de cromatina e núcleo, e extrusão dos núcleos altamente condensadas 5.
Nossa compreensão do terminal deeritropoiese tem melhorado muito nas últimas décadas, que é em grande parte devido ao sucesso do uso de vários in vitro e in vivo de mouse 6-9. Entre estes modelos, a cultura in vitro de rato fetal eritroblastos fígado proporciona muitas vantagens, incluindo a facilidade de purificação de células, proliferação e diferenciação rápida, e um mímico mais perto da eritropoiese humano 10,11. Neste sistema, um grande número de células progenitoras eritróides a partir de fígados de rato fetais pode ser facilmente isolado por purificação a única etapa de Ter119 (um marcador para as células eritróides maduras) eritroblastos negativos. Durante a cultura de dois dias dos eritroblastos, a diferenciação destas células podem ser monitorizados por uma análise de citometria de fluxo com base na expressão de superfície do receptor de transferrina (CD71) e o antigénio Ter119 12. Além disso, a enucleação dos eritroblastos de diferenciação terminal pode ser detectada por uma máquina de ADN (Hoechst 33342) 13. Além disso, as células progenitoras purificadas, pode ser geneticamente modificada por expressão de ADNc exógeno ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse, o que facilita os estudos mecanicistas das funções de expressão do gene na eritropoiese 11,13,14.
Por outro lado, a rápida taxa de crescimento celular podem ser uma espada de dois gumes, uma vez que é difícil de caracterizar as funções de genes em diferentes fases da eritropoiese terminal. Na maioria dos casos, é difícil determinar se a funções de genes específicos na fase precoce da eritropoiese terminal de desde pelo tempo que o ADNc ou shRNAs expressa, as células já passou da fase precoce. Para resolver este problema, foi desenvolvido um sistema único para dissecar os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Para a fase inicial da eritropoiese terminal, geneticamente modificados Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio livre de Epo, mas que contém o factor de células estaminais (SCF), IL-6 e FLT3ligante para manter seu status progenitor e permitir que os cDNAs transduzidas ou shRNA a expressão 13. As células foram mudadas para meio contendo EPO depois de 12 horas para induzir a proliferação e diferenciação celular. Desta forma, quando as células se diferenciaram, os cDNAs foram transduzidas ou shRNAs já expressa. Para o estágio tardio da eritropoiese terminal, Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio contendo EPO, imediatamente após a transdução. Portanto, pode-se analisar as funções dos genes de interesse na fase tardia da eritropoiese terminal. Em resumo, uma ampla aplicação deste sistema ajudaria funções dos genes dissecar em diferentes estágios de eritropoiese terminal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui apresentamos um sistema único para analisar cronologicamente rato fetal eritropoiese terminal de fígado. Através da aplicação de diferentes condições de cultivo, dissecamos sucesso eritropoiese terminais em fases precoces e tardias. Isto é particularmente importante para determinar os mecanismos de genes com funções múltiplas. Por exemplo, GTPases Rac desempenham papéis importantes em diferentes estágios de eritropoiese terminal. Inibição de Rac GTPases na fase inicial de diferenciação e prolifera?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pelo NIH R00HL102154, e um da American Society of Hematology prêmio estudioso a P Ji.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
| holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
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