時空のCaを測定する<sup> 2 +</supシロイヌナズナ植物における>シグナル

Summary

のCa ^{2 +}シグナル伝達は、植物において、多様な生物学的プロセスを調節する。ここでは、遺伝的にコード化されたのCa ^{2 +}指標エクオリンまたはCASE12を使用して、シロイヌナズナの細胞および組織内の空間的および時間的のCa ^{2 +}シグナルを誘発した非生物的ストレスを監視するためのアプローチを提示します。

Abstract

発生および環境信号は、植物細胞内のCa ^{2 +}の変動を誘発する。刺激固有の空間-時間のCa ^{2 +}のCa ^{2 +}のパターンは、シグナル伝達カスケードを開始し、携帯のCa ^{2 +}結合タンパク質によって感知される。しかし、私たちはまだ、特定のCa ^{2 +}シグナルが生成される刺激方法について少し知っている。のCa ^{2 +}シグナルの特異性は、与えられた刺激に応答してのCa ^{2 +}チャネルおよび/ ​​またはトランスポーターの活性の洗練されたレギュレーションに起因し得る。これらの細胞成分を同定し、その機能を理解するには、組織や細胞レベルの両方でのCa ^{2 +}シグナルの高感度かつ堅牢な記録を可能にするシステムを使用することが重要です。異なる細胞区画を標的とする遺伝的にコードされたのCa ^{2 +}指標は、携帯のCa ^{2 +}シグナルの生細胞の共焦点イメージングのためのプラットフォームを提供してきた。ここでは、命令を記述する2のCa ^{2 +}の検出システムを使用するためのsが：FAS（フィルム接着剤の苗）の発光のCa ^{2 +}イメージングおよびCASE12ベースの生細胞共焦点蛍光カルシウム^{2 +}イメージングベースのエクオリン。 CASE12を用いて生細胞の共焦点イメージングは、高解像度でのサイトゾルおよび核のCa ^{2 +}シグナルの同時検出を提供しながら、FASシステムを用いた発光イメージングは、組織レベルでの空間的および時間的のCa ^{2 +}シグナルの単純な堅牢かつ高感度な検出を提供する。

Introduction

植物細胞は、細胞の行動を調整するシグナリングを介して環境に応答する。環境刺激に応答してイベントをシグナリング初期の細胞は一過性のCa ^{2 +}の増加である。遊離Ca ^{2 +}濃度のパターン、または一過性の上昇の署名は、その振幅、周波数、および期間によって特徴付けられる。個別時空間のCa ^{2 +}署名は異なる細胞活性^1を調節する。例えば、熱、寒さ、塩、干ばつ、光、植物ホルモンなどの具体的な刺激は、微調整も膜局在のCa ^{2 +}チャネルおよび/ ​​またはトランスポーターの時空間的アクティビティを、特定のCa ^{2 +}の署名を得た。のCa ^{2 +}輸送体が十分に特徴付けされているが、ほとんどの植物¹におけるCa ^{2 +}チャネルの分子アイデンティティおよび機能についてはほとんど知られていない。ストレス刺激するために、変化したのCa ^{2 +}応答を持つ変異体についての遺伝子スクリーニングが効果的APPRかもしれのCa ^{2 +}の署名を構成するコンポーネントを識別するためのoach。最近、いくつかのイクオリンベースのCa ^{2 +}検出システムは、病原体の攻撃および非生物的ストレス^2-4に反応してCaのための遺伝子スクリーニング^{2 +}シグナル伝達成分を容易に開発されている。

イクオリンは、まず1990年代初期⁵植物におけるCa ^{2 +}シグナルを検出した。それ以来、イクオリンは、特定のCa ²セルを監視するためにそのような細胞質^5、核⁶などの異なる細胞区画に、葉緑体^7、8、ミトコンドリア^9、および間質¹⁰液胞膜と同様に、ルート内の異なる細胞型に標的化されています⁺シグナル^11。エクオリンベースのCa ^{2 +}測定は、ストレス刺激する細胞の集団の空間的および時間的のCa ^{2 +}応答を明らかにする。しかし、ほとんどの場合、単一の細胞のCa ^{2 +}応答はunsynchroniある応答組織⁴にゼット。そのため、イクオリンのCa ^{2 +}記録は、必ずしも個別のセル内のCa ^{2 +}シグナルを報告しません。近年では、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質（FP）は、黄色カメレオンなどのCa ^{2 +}指標^{（YCS）12を}ベースとCASEs12 ^13は、Caを研究するために使用されている^{2 +}高細胞下解像度とシグナリング。 YCSある蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、CFPを含む、カルシウム^{2 +}指標をベースとYFPのCa ^{2 +}の結合タンパク質のカルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドM13によって連結された変異体。それは、Ca ^{2 +}に結合するようにカルモジュリン、それによって増加したエネルギー移動（FRET強化）で、その結果、より緊密CFPとYFPをもたらし、コンホメーション変化を受ける。 CFPシグナル強度に対するYFPの比として概算時間をかけてFRETレベルは、細胞内Ca ^{2 +}動態を反映している。いくつかのYCバージョンが植物において使用されている。 YC3.6 tはあった細胞質ゾル^14,15、核^16、ミトコンドリア^17、および原形質膜^18、およびYC4.6とD4ERにargetedは、ER ^15,19をターゲットとし、D3cpvはペルオキシソーム²⁰を対象とした。 YCSを発現するトランスジェニック植物は、異なる細胞型の異なる細胞区画内のCa ^{2 +}動態の生細胞イメージングを可能にする。ケース（おそらくカルシウム lcium SE nsor）がカルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドM13を保有する単一の円順列蛍光タンパク質（cpFPs）です。のCa ^{2 +}に結合すると、ケースは、蛍光強度の増加をもたらす、コンフォメーション変化を受ける。 CASEの蛍光応答およびCa ^{2 +}濃度との相関は、細胞内Ca ^{2 +}動態を定量的に測定することができる。 CASE12変異体は、12倍のCa ^{2 +} -飽和形で蛍光が増加している。N. benthiminanaプラント過渡的にはexprディエッサーCASE12または安定的にケース12を発現しているシロイヌナズナ植物が防御と非生物的ストレス^4,21中のCa ^{2 +}シグナル伝達を研究するために使用された。病原体の攻撃に、または乾燥ストレスに応答する細胞内のCa ^{2 +}の非同期空間的および時間的な振動がCASE12ベースのCa ^{2 +}イメージングで明らかにされている。

ここでは、シロイヌナズナの苗において、組織との刺激特定のCA ^{2 +}動態のエクオリンに基づく発光イメージングのための詳細な手順を提示、およびFASのケース12発光イメージングを表現シロイヌナズナの根の細胞内の細胞質ゾルおよび核のCa ^{2 +}動態の共焦点イメージングのためのストレス誘発性のCaここでは記載していない無傷の植物又は組織における^{2 +}動態を分析するために適合させることができる、またはCa ^{2 +}シグナルを誘導し、変更された応力を有する変異体のための突然変異誘発シロイヌナズナ植物集団をスクリーニングする。生細胞のCa ^{2 +}イメージングセットアップは、Caを分析するために適合させることができる他のCa ^{2 +}指標を使用して、異なるsubcelluarコンパートメント内または異なる細胞型において2 +動態。

Protocol

FASシステムを用いた1イクオリンベースのCA 2 +イメージング発光イメージングのための苗木を準備します。 0.01％のTriton-100を含有する10％漂白溶液でエクオリンを発現するArabidopsis植物の種子を滅菌する。フル強度MS（ムラシゲ·スクーグ基礎塩混合物）、1％スクロース、1.2％寒天を含む角板（グリッド10×10cmの正方形のペトリ皿）上で無菌種をまく。 2日間（ 図1A）、4℃<…

Representative Results

マンニトール、NaClおよびH 2 O 2は、それぞれ、脱水、塩および酸化ストレス刺激のためのプロキシとして使用した。重金属イオンのCu 2 +は、これら三つのストレス刺激のいずれかと相乗作用しているかどうかを確認するために、私たちは、Cu 2 +の存在下または非存在下でそれぞれの刺激に対するCa 2 +応答を比較した。 図2に示されるように…

Discussion

私たちは、シロイヌナズナの苗の時空間のCa ^{2 +}応答を記録するためのFASシステムを実証している。このFASのCa ^{2 +}記録方式がここに提示されている非生物的ストレス刺激に加えて、さまざまな刺激によって誘発のCa ^{2 +}動態を測定するために適合させることができる、単純な感度かつロバストな手法を提供する。このシステムを用いて、簡単に植物全体レベルでの組織ま?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG