Medindo espacial e temporal Ca^{2 +} Sinais em Arabidopsis Plantas

Summary

Sinalização de Ca2 ⁺ regula diversos processos biológicos em plantas. Aqui apresentamos abordagens para monitorar o estresse abiótico induzida Ca espacial e temporal ^{2 +} sinais em células e tecidos, utilizando os codificados geneticamente ^Ca2 indicadores aequorin ou case12 Arabidopsis.

Abstract

Sinais ambientais e de desenvolvimento induzir oscilações de Ca2 ⁺ em células de plantas. Espaço-temporais de Ca2 ⁺ padrões específicos de estímulo são detectados por proteínas Ca2 ⁺ ligação celulares que iniciam ^{Ca2 +} cascatas de sinalização. No entanto, ainda sabemos pouco sobre como estímulo sinais de Ca ^{2 +} específico são gerados. A especificidade de um sinal de ^{Ca2 +} pode ser atribuído à regulação sofisticados das actividades dos canais de ^{Ca2 +} e / ou transportadores, em resposta a um dado estímulo. Para identificar estes componentes celulares e compreender as suas funções, é essencial a utilização de sistemas que permitem a gravação sensível e robusto de sinais de Ca ^{2 +} em ambos os tecidos e níveis celulares. Codificados geneticamente ^Ca2 indicadores que são direcionados para diferentes compartimentos celulares têm proporcionado uma plataforma para células vivas imagem confocal de celulares Ca2 ⁺ sinais. Aqui descrevemos instruçãos para a utilização de dois sistemas de detecção de Ca ^{2 +:} aequorina baseado FAS (mudas adesivas película luminescência) de Ca2 ⁺ e de imagiologia case12 confocal de fluorescência de células vivas com base de Ca2 ⁺ de imagem. Imaging luminescência usando o sistema FAS fornece uma detecção simples, robusto e sensível de Ca2 ⁺ sinais espaciais e temporais em nível tecidual, enquanto células vivas imagem confocal usando case12 fornece detecção simultânea de citosólica e Ca2 ⁺ sinais nucleares em uma resolução alta.

Introduction

A célula de planta responde ao meio ambiente através de sinalização que coordena as acções de células. Um evento de sinalização precoce de células em resposta a estímulos do meio ambiente é um aumento transitório de Ca2 ^+. O padrão, ou a assinatura de um aumento transitório da concentração de Ca2 ⁺ livre é caracterizado pela sua amplitude, frequência e duração. Assinaturas Ca2 ⁺ espaço-temporais distintas regular diferentes atividades celulares ^1. Estímulos específicos, como o calor, o frio, o sal, a seca, a luz, ou hormônios vegetais, pode ajustar a atividade espaço-temporal localizada à membrana canais de Ca2 ⁺ e / ou transportadores, resultando em específicos de Ca2 ⁺ assinaturas. Embora os transportadores de Ca2 ⁺ têm sido bem caracterizados, pouco é conhecido sobre as identidades molecular e as funções de canais de Ca ^{2 +} em plantas ^1. Telas genéticos para os mutantes com alteração de Ca2 ⁺ resposta ao estresse pode ser um estímulo eficaz aproxoach para identificar os componentes que compõem Ca2 ⁺ assinaturas. ^Ca2 sistemas de detecção com base recentemente vários Aequorina têm sido desenvolvidos que facilitam telas genéticos para componentes de sinalização de Ca2 ⁺ em resposta a ataque patogénico e stress abiótico ^2-4.

Aequorina foi usado pela primeira vez para detectar sinais de Ca2 ⁺ em plantas no início de 1990 ^5. Desde então, a Aequorina foi orientada para diferentes compartimentos celulares, tais como o ⁵ citoplasma, núcleo ^{6, 7} cloroplastos, tonoplast ^{8, 9} mitocôndrias, e estroma ^10, bem como para diferentes tipos de células na raiz para monitorar célula específica de Ca ^{2 +} sinais ^11. Medições de Ca ^{2 +} base de Aequorina revelar o espacial e temporal de Ca2 ⁺ resposta de uma população de células ao estresse estímulos. No entanto, na maioria dos casos, as respostas do Ca2 ⁺ de células individuais são unsynchronized no tecido respondendo ^4. Por conseguinte, a Aequorina Ca2 ⁺ gravação não necessariamente comunicar o sinal de Ca2 ⁺ em células individuais. Nos últimos anos, a proteína fluorescente geneticamente codificado (FP) à base de Ca2 ⁺ de indicadores, tais como cameleon amarelo (YCS) ¹² e ¹³ casos12 têm sido utilizados para estudar a sinalização de Ca2 ⁺ com alta resolução subcelular. YCS são fluorescência transferência de energia de ressonância (FRET) à base de Ca ^{2 +} indicadores, contendo PCP e YFP variantes ligadas pela Ca2 ⁺ liga�o ao calmodulina proteínas e peptídeos de ligação à calmodulina M13. A calmodulina sofre uma alteração conformacional, uma vez que se liga a Ca ^{2 +,} pondo assim PCP e YFP mais juntos, o que resulta num aumento da transferência de energia (reforçada FRET). O nível de FRET ao longo do tempo, calculada aproximadamente como a razão entre a intensidade do sinal YFP PCP, reflecte intracelular de Ca2 ⁺ dinâmica. Várias versões YC têm sido utilizados em plantas. YC3.6 era targeted para o citosol ^14,15, núcleo ^{16, 17} mitocôndrias e membrana plasmática ^18, e YC4.6 e D4ER foram direcionados para o ER ^15,19, e D3cpv foi direcionada para os peroxissomos ^20. Plantas transgênicas expressando YCS permitir a geração de imagens de células vivas de Ca2 ⁺ dinâmica em diferentes compartimentos celulares de diferentes tipos de células. Casos (presumivelmente Ca lcium se nsor) são proteínas simples permuta circular fluorescentes (cpFPs) abrigam uma calmodulina e peptídeos de ligação à calmodulina M13. Após a ligação ao Ca2 ^+, os casos sofrer alterações conformacionais, que conduz a um aumento da intensidade da fluorescência. A correlação entre a resposta da fluorescência do CASE e concentração de Ca2 ⁺ permite intracelular de Ca2 ⁺ dinâmica a ser medido quantitativamente. A variante case12 tem 12 vezes maior de fluorescência nas Ca2 ⁺ formas saturados. N. plantas benthiminana transitoriamente expressing case12 ou plantas de Arabidopsis expressando estavelmente Caso 12 foram usados ​​para estudar Ca ^{2 +} sinalização na defesa e abióticos de estresse ^4,21. Asynchronous espacial e temporal ^Ca2 oscilações nas células respondem ao ataque de patógenos, ou ao estresse desidratação foram revelados com base case12 Ca2 ⁺ imagem.

Aqui, apresentamos instruções detalhadas para a Aequorina imagem luminescência base de Tecido e estímulos específicos ^Ca2 dinâmica em plântulas de Arabidopsis, e por imagem confocal de citosólica e Ca ^{2 +} dinâmica nuclear em células das raízes de Arabidopsis que expressam Caso 12 luminescência de imagem de FAS pode ser adaptado para analisar induzidas pelo stress ^Ca2 dinâmica em plantas ou tecidos intactos não descritos aqui, ou para pesquisar populações de plantas de Arabidopsis mutantes por mutagénese com o stress alterado induzido ^Ca2 sinais. A configuração da imagem de células vivas de Ca2 ⁺ pode ser adaptado para analisar Ca2 + dinâmica em diferentes compartimentos subcelluar ou em diferentes tipos de células utilizando outros indicadores de Ca2 ^+.

Protocol

1. Aequorina Based Ca2 + Imagem Usando o Sistema FAS Preparar mudas para imagens de luminescência. Esterilizar as sementes de plantas de Arabidopsis expressando a Aequorina com uma solução de lixívia a 10% contendo 0,01% de Triton-100. Semear as sementes estéreis sobre uma placa quadrada (10 x 10 cm quadrados placa de Petri com grade,) contendo força total MS (Murashige e Skoog Basal Mistura de sal), 1% de sacarose, e 1.2% de ágar. Colocar as placas verticalmente em uma câmara de cresciment…

Representative Results

Manitol, NaCl e H 2 O 2 foram usados ​​como proxies para a desidratação, de sal e de estresse oxidativo estímulos, respectivamente. Para verificar se o ião de metal pesado Cu2 + sinergiza com qualquer destes três estímulos de stress, comparou-se a resposta de Ca 2 + a cada estímulo na presença ou ausência de Cu2 +. Como mostrado na Figura 2, o FAS luminescência imagiologia revelou que as plântulas Arabidoposis responderam diferentemen…

Discussion

Nós demonstramos um sistema FAS para a gravação do espaço-temporal de Ca2 ⁺ resposta de mudas de Arabidopsis. Este FAS Ca2 ⁺ sistema de gravação proporciona uma abordagem simples, sensível e robusto, que pode ser adaptado para medir a ^Ca2 dinâmica desencadeada por estímulos diversos, para além dos estímulos de stress abiótico, que são aqui apresentados. Usando este sistema, podemos facilmente comparar tecido- ou específicos de estímulos espaço-temporais Ca2 ⁺ d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG