측정 공간적 칼슘<sup> 2 +</sup애기 장대 식물에서> 신호

Summary

^칼슘 신호는 식물에서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 여기에 우리가 공간과 시간 칼슘에 의한 비 생물 적 스트레스를 모니터링하기위한 방법을 제시 애기 세포와 유전자 인코딩 ^칼슘 지표 애큐 오린 또는 Case12를 사용하여 조직에 ^{2 +} 신호.

Abstract

발육 및 환경 단서 칼슘보기 식물 세포에서 ²⁺ 변동을 유도한다. 자극 특정 시공간 ^칼슘 패턴이 ^칼슘 신호 폭포를 시작 세포의 ^칼슘 결합 단백질에 의해 감지된다. 그러나, 우리는 여전히 특정 ^칼슘 신호가 생성되는 자극 방법에 대한 약간 알고있다. ^칼슘 신호의 특이성은 주어진 자극에 응답하여 ^칼슘 이온 채널들 및 / 또는 전송기의 활동 정교한 조절에 기인 할 수있다. 이들 세포 성분을 식별하고 그들의 기능을 이해하기 위해서는 조직 및 세포 수준에서 모두 ^칼슘 신호를 구분하고 강력한 기록을 허용 시스템을 사용하는 것이 중요하다. 서로 다른 세포 구획을 대상으로 유전자 인코딩 ^칼슘 지표 세포 ^칼슘 신호의 라이브 세포 공 촛점 이미징을위한 플랫폼을 제공하고 있습니다. 여기에서 우리는 명령을 설명이 ^칼슘 감지 시스템의 용도들 : FAS (필름 점착 모종), 발광 ^칼슘 이미징 기반 case12 생균 공 초점 형광 ^칼슘 이미징 기반의 애큐 오린. Case12를 이용한 생균 공 촛점 이미지는 높은 해상도 세포질과 핵 ^칼슘 신호의 동시 검출을 제공하면서 FAS 시스템을 사용하여 발광 이미징은 조직 수준에서 시공간적 ^칼슘 신호의 단순 견고하고 민감한 검출을 제공한다.

Introduction

식물 세포는 세포의 행동을 통해 시그널링 좌표 환경에 응답한다. 환경 자극에 대한 응답으로 이벤트를 신호 초기 셀은 일시적인 ^칼슘 증가이다. 자유 ^칼슘 농도의 패턴, 또는 일시적인 증가의 서명은 그 진폭, 주파수 및 시간에 의해 특징된다. 고유 시공간 ^칼슘 서명은 다른 세포 활동 ^한을 조절한다. 열, 냉기, 소금, 가뭄, 빛, 또는 식물 호르몬과 같은 특정 자극, 미세 조정할 수 막 화 된 ^칼슘 채널 및 / 또는 수송의 시공간적 활동을, 특정 ^칼슘 서명 결과. ^칼슘 수송이 잘 특징으로되어 있지만, 작은 식물 ^{하나의 칼슘} 채널의 분자 정체성과 기능에 대한 알려져있다. 자극을 강조하는 변경 ^칼슘 반응과 돌연변이에 대한 유전 스크린은 효과적인 APPR 수 있습니다^칼슘 서명을 구성하는 구성 요소를 식별하기위한 oach. 최근 몇 애큐 오린 기반 ^칼슘 탐지 시스템은 병원균의 공격과 비 생물 적 스트레스 ^2-4에 대한 응답으로 구성 요소를 신호 칼슘 ^2에 대한 유전 화면을 용이하게 개발되었다.

애큐 오린 처음 1990 년대 초에 ⁵ 칼슘보기 식물체에서 ^{2 +} 신호를 검출하는데 사용되었다. 그 이후로, 애큐 오린은 같은 ^칼슘이 특정 세포를 모니터링 할 수있는 루트에서 ⁸ tonoplast 세포질 ^5, 핵 ^6, 엽록체 ^7, 미토콘드리아 ^9, 간질 ^열뿐만 아니라, 서로 다른 종류의 세포 등 다양한 세포 구획을 타겟으로하고있다 ⁺ 신호 ^11. 애큐 오린 기반 ^칼슘 측정은 자극을 강조하는 세포 집단의 공간과 시간 ^칼슘 반응을 알 수있다. 그러나 대부분의 경우, 하나의 셀의 ^칼슘 반응 unsynchroni 아르응답 조직 ^사에 데이빗. 따라서, 애큐 오린 ^칼슘 기록은 반드시 각각의 세포에서 ^칼슘 신호를보고하지 않습니다. 최근 몇 년 동안, 유전자 인코딩 형광 단백질 (FP)는 높은 해상도로 세포 내 신호 칼슘 ^2를 연구하는 데 사용 된 칼슘에게 같은 노란색 카멜레온 (YCS) ¹² CASEs12 ⁽¹³⁾ 등 ^{2 +} 지표를 기반. YCS는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)는 CFP를 포함, 칼슘에게 ^{2 +} 지표를 기반 및 YFP이 단백질 칼 모듈 린과 칼 모듈 린 결합 펩티드 M13을 -binding ^{2 +} 칼슘에 의해 연결된 변종입니다. 이 ^칼슘 결합으로 칼 모듈 린함으로써 증가 된 에너지 전달 (FRET 강화)의 결과로, 더 가깝게 CFP와 YFP을 제공, 구조적 변화를 겪는다. CFP 신호 강도에 YFP의 비율로 대략적으로 계산 된 시간에 따른 FRET 레벨은, 내 Ca ^{2 +보기} 역학을 반영한다. 여러 YC 버전은 식물에서 사용되어왔다. YC3.6은 t이었다세포질 ^{14, 15, 16} 핵, 미토콘드리아 ⁽¹⁷⁾ 및 세포막 ^(18), 그리고 YC4.6 및 D4ER에 argeted는 ER ^15,19를 대상으로하고, D3cpv는 퍼 옥시 솜 ^(20)을 대상으로 하였다. YCS를 발현하는 형질 전환 식물은 서로 다른 세포 유형의 서로 다른 세포 구획 내 ^칼슘 역학의 라이브 세포 이미징을 할 수 있습니다. 케이스 (아마도 칼슘 lcium 자체 nsor)는 칼 모듈 린과 칼 모듈 린 결합 펩티드 M13을 품고 하나의 원 순열 형광 단백질 (cpFPs)입니다. ^칼슘 이온에 결합되면, 경우는 형광 강도의 증가로 이어지는 구조 변화를 겪는다. CASE의 형광 반응과 ^칼슘 이온 농도의 상관 관계는 세포 내 ^칼슘 역학을 정량적으로 측정 할 수 있습니다. Case12 변형이 12 배는 ^칼슘 포화 지방 형태로 형광을 증가했다. N. benthiminana 식물 일시적으로 EXPR싱 Case12 또는 안정적으로 케이스 (12)를 표현하는 애기 장대 식물은 방어와 비 생물 적 스트레스 ^{4,21에서 칼슘} 신호 전달을 연구하는 데 사용되었다. 또는 탈수 스트레스에 병원균의 공격에 대응하는 세포에서 비동기 공간과 시간 ^칼슘 진동은 Case12 기반의 ^칼슘 이미징 공개되었다.

여기서 우리는 애기 모종 ^{2 +} 역학 칼슘 특정하고, 세포질의 공 초점 이미징 및 핵 CA의 조직 -와 자극의 애큐 오린 기반 발광 이미징에 대한 자세한 지침을 제시 FAS의 케이스 (12) 발광 영상을 표현 애기 루트 세포 ^{2 +} 역학 그대로 식물 또는 여기에 설명되지 않은 조직에서 스트레스에 의한 ^칼슘 역학을 분석하기 위해, 또는 ^{2 +} 신호 칼슘에 의한 변형 된 스트레스와 돌연변이에 대한 돌연변이 애기 장대 식물 집단을 선별 적용 할 수있다. 라이브 세포 ^칼슘 영상 설정은 칼슘을 분석하기에 적합 할 수다른 ^칼슘 지표를 사용하여 다른 subcelluar 구획 내에서 또는 서로 다른 세포 유형에서 2 + 역학.

Protocol

FAS 시스템을 사용하여 1 애큐 오린 기반 칼슘 이미징 발광 이미징을위한 모종을 준비합니다. 0.01 % 트리톤-100를 포함하는 10 % 표백제 용액으로 애큐 오린을 표현 애기 장대 식물의 종자를 소독. 전체 강도 MS (무라 시게와 스쿡 기초 소금의 혼합물), 1 %의 자당, 1.2 % 한천을 포함하는 사각형 접시 (격자 10 × 10cm 사각형 페트리 접시)에 멸균 씨앗을 뿌리고. 수직으로 이일 4 ° C (그…

Representative Results

만니톨, 염화나트륨 및 H 2 O 2는 각각, 탈수, 소금 및 산화 스트레스 자극에 대한 프록시로서 사용 하였다. 중금속 이온의 Cu 2 +이 세 스트레스 자극 중 어느 synergizes 여부를 확인하기 위해, 우리는 2 +의 Cu의 존재 또는 부재의 각 자극에 칼슘 응답을 비교 하였다. 그림 2에 나타낸 바와 같이, FAS 발광 이미징 Arabidoposis 모종 탈수, 소금, 산화 스트레…

Discussion

우리는 애기 장대 모종의 공간 – 시간 ^칼슘 응답을 기록하는 FAS 시스템을 증명하고있다. 이 FAS ^칼슘 기록 시스템은 칼슘 여기되게됩니다 비 생물 적 스트레스 자극뿐만 아니라 다양한 자극에 의해 발생 ^{2 +} 역 동성을 측정하기 위해 적용 할 수있는, 간단한 민감하고 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 쉽게 전체 플랜트 레벨에서 조직 – 또는 자?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG