قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا²⁺ إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Summary

كاليفورنيا ²⁺ إشارات تنظم العمليات البيولوجية المختلفة في النباتات. هنا نقدم النهج لرصد يسببها الإجهاد اللاحيوي الكالسيوم المكاني والزماني ²⁺ الإشارات في الخلايا والأنسجة باستخدام المشفرة وراثيا الكالسيوم ²⁺ مؤشرات Aequorin أو Case12 نبات الأرابيدوبسيس.

Abstract

العظة الإنمائية والبيئية تحفز الكالسيوم ²⁺ التقلبات في الخلايا النباتية. ومست المكانية والزمانية الكالسيوم ²⁺ أنماط التحفيز محددة من الكالسيوم ²⁺ ملزم البروتينات الخلوية التي تبدأ الكالسيوم ²⁺ يشير شلالات. ومع ذلك، ما زلنا لا نعرف إلا القليل حول كيفية التحفيز تتولد إشارات الكالسيوم معين ^2+. ويمكن أن يعزى خصوصية إشارة الكالسيوم ²⁺ لتنظيم متطورة لأنشطة قنوات الكالسيوم ²⁺ و / أو الناقلين في استجابة لحافز معين. لتحديد هذه المكونات الخلوية وفهم وظائفها، لا بد من استخدام الأنظمة التي تسمح تسجيل حساسة وقوية من إشارات الكالسيوم ²⁺ في كل من الأنسجة الخلوية والمستويات. وقد وفرت المشفرة وراثيا الكالسيوم ²⁺ المؤشرات التي تستهدف مقصورات الخلوية المختلفة منبرا للخلية الحية التصوير متحد البؤر الخلوية من الكالسيوم ²⁺ الإشارات. نحن هنا وصف التعليمق لاستخدام اثنين من الكالسيوم ²⁺ أنظمة الكشف: aequorin FAS (فيلم الشتلات لاصق) التلألؤ الكالسيوم ²⁺ التصوير وcase12 استنادا الخلية الحية متحد البؤر مضان الكالسيوم ²⁺ التصوير القائم. التصوير التلألؤ باستخدام نظام FAS يوفر الكشف بسيطة وقوية وحساسة من المكانية والزمانية الكالسيوم ²⁺ إشارات على مستوى الأنسجة، في حين أن الخلية الحية التصوير متحد البؤر باستخدام Case12 يتيح الكشف المتزامن للعصاري خلوي والكالسيوم النووية ²⁺ إشارات بدقة عالية.

Introduction

في الخلية النباتية وتستجيب للبيئة عن طريق الإشارات التي تنسق أعمال الخلية. خلية مبكرة يشير الحدث في الاستجابة للمؤثرات البيئية هي عابرة زيادة الكالسيوم ^2+. يتميز نمط، أو التوقيع على زيادة عابرة في حر تركيز الكالسيوم في ²⁺ من السعة، والتردد، والمدة. المكانية والزمانية التوقيعات الكالسيوم ²⁺ متميزة تنظم الأنشطة الخلوية المختلفة ^1. محفزات معينة، مثل الحرارة والبرودة، والملح، والجفاف، والضوء، أو الهرمونات النباتية، قد صقل النشاط المكانية والزمانية من المترجمة الغشاء قنوات الكالسيوم ²⁺ و / أو النقل، مما أدى محددة كا ²⁺ التوقيعات. على الرغم من الكالسيوم ²⁺ النقل اتسمت أيضا، لا يعرف إلا القليل عن الهويات الجزيئية وظائف قنوات الكالسيوم ²⁺ في النباتات ^1. شاشات الجينية للالمسوخ مع تغيير كا ²⁺ ردا على التأكيد على المحفزات قد تكون فعالة approach لتحديد المكونات التي تؤلف التوقيعات الكالسيوم ^2+. وقد وضعت كا ²⁺ أنظمة الكشف مؤخرا العديد Aequorin استنادا التي تسهل شاشات الجينية للكا ²⁺ يشير مكونات ردا على مهاجمة مسببات الأمراض والإجهاد اللاحيوي ^2-4.

وقد استخدم Aequorin أول من كشف الكالسيوم ²⁺ إشارات في النباتات في وقت مبكر 1990s ^5. منذ ذلك الحين، تم استهداف Aequorin إلى مقصورات الخلوية المختلفة، مثل السيتوبلازم ^5، نواة ^{6، 7} البلاستيدات الخضراء، tonoplast ^{8، 9} الميتوكوندريا، ^و10 سدى، فضلا عن أنواع مختلفة من الخلايا في جذر لمراقبة خلية معينة كا ^{2 +} إشارات ^11. تكشف القياسات الكالسيوم Aequorin استنادا ²⁺ والمكانية والزمانية الكالسيوم ²⁺ استجابة من مجموعة من الخلايا التأكيد على المحفزات. ومع ذلك، في معظم الحالات، ردود ²⁺ الكالسيوم من الخلايا واحدة هي unsynchroniزيد في الأنسجة الاستجابة ^4. لذا، وتسجيل Aequorin الكالسيوم ²⁺ لا تفيد بالضرورة إشارة ²⁺ الكالسيوم في الخلايا الفردية. في السنوات الأخيرة، المشفرة وراثيا بروتين فلوري (FP) القائم على الكالسيوم ²⁺ المؤشرات، مثل كمليون الأصفر (YCS) ¹² و ¹³ CASEs12 استخدمت لدراسة كا ²⁺ يشير لقرار التحت خلوية عالية. YCS هي مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) القائم على الكالسيوم ²⁺ المؤشرات، التي تحتوي على CFP YFP والمتغيرات التي ترتبط كا ²⁺ -binding كالمودولين البروتين والببتيد كالمودولين ملزم M13. كالمودولين تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين جزئي كما يرتبط الكالسيوم ^2+، مما يجلب CFP YFP وأقرب معا، مما يؤدي إلى زيادة نقل الطاقة (تعزيز الحنق). مستوى الحنق على مر الزمن، وتحسب تقريبا كنسبة من YFP إلى CFP شدة إشارة، يعكس الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ ديناميات. وقد استخدمت العديد من إصدارات البطاقة الصفراء في النباتات. كان YC3.6 رargeted إلى العصارة الخلوية ^{14،15، 16} النواة، الميتوكوندريا ^17، وغشاء البلازما ^18، وYC4.6 وD4ER استهدفت ER إلى ^15،19، واستهدف D3cpv إلى peroxisomes ^20. النباتات المعدلة وراثيا معربا عن YCS تسمح التصوير الخلية الحية من الكالسيوم ²⁺ ديناميات داخل مقصورات الخلوية المختلفة من أنواع مختلفة من الخلايا. الحالات (ويفترض الكالسيوم lcium حد ذاته nsor) هي بروتينات واحدة دائري مبدل الفلورسنت (cpFPs) بايواء وكالمودولين ملزم كالمودولين الببتيد M13. على الربط إلى الكالسيوم ^2+، وحالات تخضع التغييرات متعلق بتكوين، مما يؤدي إلى زيادة كثافة مضان. العلاقة بين استجابة مضان كيس والكالسيوم تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ يسمح ²⁺ ديناميات المراد قياسها كميا. البديل Case12 تمت زيادة 12 أضعاف في مضان أشكال -saturated الكالسيوم ^2+. N. النباتات benthiminana عابر EXPRاستخدمت essing Case12 أو النباتات نبات الأرابيدوبسيس التعبير عن ثابت 12 حالة لدراسة كا ²⁺ الإشارات في الدفاع والضغط ^4،21 أحيائية. وقد كشف غير المتزامن الكالسيوم المكاني والزماني ²⁺ التذبذبات في خلايا الاستجابة للهجوم الممرض، أو للإجهاد الجفاف مع Case12 مقرها كاليفورنيا ²⁺ التصوير.

هنا، نقدم تعليمات مفصلة لAequorin التصوير التلألؤ على أساس من نسيجيا والمحفزات محدد الكالسيوم ²⁺ ديناميكية في شتلات نبات الأرابيدوبسيس، والتصوير متحد البؤر من عصاري خلوي والكالسيوم النووي ²⁺ ديناميكية في الخلايا الجذرية نبات الأرابيدوبسيس التي تعبر عن حالة 12. التلألؤ التصوير FAS يمكن تكييفها لتحليل الإجهاد الناجم عن الكالسيوم ²⁺ ديناميكية في النباتات أو الأنسجة غير الوارد وصفها هنا سليمة، أو لفحص mutagenized السكان نبات نبات الأرابيدوبسيس لالمسوخ مع الإجهاد الناجم غيرت الكالسيوم ²⁺ الإشارات. يمكن أن تتكيف الخلية الحية الكالسيوم ²⁺ الإعداد التصوير لتحليل الكالسيوم2+ ديناميات داخل مقصورات subcelluar مختلفة أو في أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى باستخدام المؤشرات الكالسيوم ^2+.

Protocol

1. Aequorin القائم على الكالسيوم 2+ التصوير باستخدام نظام FAS إعداد الشتلات للتصوير التلألؤ. تعقيم البذور من النباتات نبات الأرابيدوبسيس معربا عن Aequorin مع 10٪ محلول التبييض التي تحتوي على 0.01٪ تريتون-100. زرع بذور معقمة عل?…

Representative Results

استخدمت مانيتول، كلوريد الصوديوم وH 2 O 2 كوكلاء للجفاف والملح والاكسدة المحفزات، على التوالي. للتحقق مما إذا أيون المعادن الثقيلة النحاس 2+ تنسجم مع أي من هذه المحفزات الإجهاد الثلاثة، قارنا الكالسيوم 2+ استجابة لكل المثيرات في وجود أو عدم وجود …

Discussion

لقد أثبت نظام FAS لتسجيل المكانية والزمانية الكالسيوم ²⁺ استجابة شتلات نبات الأرابيدوبسيس. يوفر هذا FAS الكالسيوم ²⁺ نظام تسجيل مقاربة بسيطة وحساسة وقوية التي يمكن تكييفها لقياس الكالسيوم ²⁺ ديناميات الناجمة عن المنبهات المختلفة بالإضافة إلى محفزات ال?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG