Meten Ruimtelijke en temporele Ca^{2 +} Signalen in Arabidopsis Planten

Summary

Ca2 ⁺ signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 ⁺ signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca ^{2 +-indicatoren} Aequorin of Case12.

Abstract

Ontwikkelings-en omgevingsfactoren veroorzaken Ca ^{2 +} schommelingen in plantencellen. Stimulus-specifieke ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +} patronen worden waargenomen door cellulaire Ca2 ^+-bindende eiwitten die Ca ^{2 +} signaleringscascades initiëren. We weten echter nog weinig over hoe stimulus specifieke Ca ^{2 +-signalen} worden gegenereerd. De specificiteit van een Ca2 ⁺ signaal kan worden toegeschreven aan de verfijnde regulering van de activiteit van Ca2 ⁺ kanalen en / of transporteurs in reactie op een bepaalde stimulus. Om deze cellulaire componenten te identificeren en begrijpen van hun functies, is het cruciaal om systemen die een gevoelige en robuuste opname van Ca ^{2 +-signalen} op zowel het weefsel en cellulaire niveau te gebruiken. Genetisch gecodeerd Ca ^{2 +-indicatoren} die gericht zijn op verschillende cellulaire compartimenten hebben een platform voor live cell confocale beeldvorming van cellulaire Ca2 ⁺ signalen voorzien. Hier beschrijven we instructies voor het gebruik van twee Ca ^{2 +} detectiesystemen: aequorin gebaseerd FAS (film lijm zaailingen) luminescentie Ca ^{2 +} imaging en case12 gebaseerd live cell confocale fluorescentie Ca ^{2 +} imaging. Luminescentie beeldvorming met behulp van de FAS-systeem biedt een eenvoudige, robuuste en gevoelige detectie van de ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +-signalen} op het weefsel niveau, terwijl de live cell confocale beeldvorming met behulp Case12 biedt gelijktijdige detectie van cytosol en nucleaire Ca ^{2 +-signalen} met een hoge resolutie.

Introduction

De plant cel reageert op het milieu via signalering die cel acties coördineert. Een vroege signaaltransductie gebeurtenis in antwoord op omgevingsstimuli een voorbijgaande Ca2 ⁺ stijging. Het patroon, of de handtekening van een tijdelijke toename van vrije Ca ^{2 +-concentratie} wordt gekenmerkt door zijn amplitude, frequentie en duur. Verschillende ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +} handtekeningen regelen verschillende cellulaire activiteiten ^1. Specifieke stimuli, zoals hitte, kou, zout, droogte, licht, of plantenhormonen, kunnen fine-tunen van de ruimtelijke en temporele activiteit van gelokaliseerde Ca ^{2 +-kanalen} en / of vervoerders, wat resulteert in specifieke Ca ^{2 +} handtekeningen. Hoewel Ca ^{2 +} transporters zijn goed gekarakteriseerd, is er weinig bekend over de moleculaire identiteit en de hoedanigheid van de Ca ^{2 +-kanalen} in planten ^1. Genetische screens voor mutanten met veranderde Ca2 ⁺ respons op stimuli benadrukken kan een effectieve ca. zijnOACH voor het identificeren van de componenten die Ca ^{2 +} handtekeningen te componeren. Onlangs gebaseerd verscheidene aequorine ^Ca2 detectiesystemen ontwikkeld dat genetische screens vergemakkelijken Ca2 ⁺ signaleringscomponenten in reactie op pathogenen attack en abiotische stress ^2-4.

Aequorine werd eerst gebruikt voor het detecteren Ca2 ⁺ signalen in planten in de vroege jaren 1990 ^5. Sindsdien aequorine is gericht op verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytoplasma ^{5, 6} nucleus, chloroplasten ^7, tonoplast ^{8, 9} mitochondria en stroma ^10, alsmede verschillende celtypen in de root celspecifieke Ca ² monitoren ⁺ signalen ^11. Aequorin gebaseerd Ca ^{2 +} metingen onthullen de ruimtelijke en temporele Ca2 ⁺ respons van een populatie van cellen op stimuli benadrukken. In de meeste gevallen, de Ca2 ⁺ responsen van afzonderlijke cellen unsynchronized in de reagerende weefsel ^4. Daarom garandeert Aequorin Ca ^{2 +} opname niet noodzakelijk verslag van de Ca ^{2 +} signaal in individuele cellen. In de afgelopen jaren, genetisch gecodeerde fluorescent eiwit (FP) gebaseerde Ca2 ⁺ indicatoren, zoals geel kameleon (YC) ¹² en gevallen12 ¹³ zijn gebruikt om Ca ^{2 +} studeren signalerend met hoge subcellulaire resolutie. YCS zijn fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) gebaseerde Ca ^{2 +-indicatoren,} met GVB en YFP varianten toegevoegd door de Ca ^{2 +} -bindende eiwit calmoduline en-calmoduline bindingspeptide M13. Calmoduline ondergaat een vormverandering als het bindt aan Ca ^{2 +,} daardoor brengt GVB en YFP dichter bij elkaar, wat resulteert in een verhoogde energie-overdracht (verbeterde FRET). De FRET level tijd, ruwweg berekend als de verhouding van YFP de GVB signaalintensiteiten, weerspiegelt de intracellulaire Ca2 ⁺ dynamiek. Verschillende YC versies zijn gebruikt in planten. YC3.6 was targeted naar het cytosol ^14,15, kern ^16, mitochondria ¹⁷ en plasmamembraan ^18, en YC4.6 en D4ER waren gericht naar de ER ^15,19, en D3cpv was gericht op de peroxisomen ^20. Transgene planten die YCS laat de live-cell imaging van Ca ^{2 +} dynamiek binnen de verschillende cellulaire compartimenten van verschillende celtypen. CASEs (vermoedelijk Ca lcium se nsor) zijn enkel circulair gepermuteerde fluorescerende eiwitten (cpFPs) drager zijn van een calmoduline en-calmoduline bindingspeptide M13. Na binding aan Ca2 ⁺ CASEs conformationele veranderingen ondergaan, leidend tot een toename van fluorescentie-intensiteit. De correlatie tussen fluorescentie respons van de behuizing en Ca2 ⁺ concentratie maakt intracellulair Ca2 ⁺ dynamiek kwantitatief te meten. De Case12 variant heeft 12-voudige toename van fluorescentie in de Ca ^{2 +} -saturated vormen. N. benthiminana planten kortstondig expressing Case12 of Arabidopsis planten stabiel tot expressie Case 12 werden gebruikt om Ca ^{2 +} signalering studeren in de verdediging en abiotische stress ^4,21. Asynchrone ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +-oscillaties} in de cellen reageren op pathogeen aanval, of om uitdroging van stress zijn geopenbaard met Case12 gebaseerd Ca ^{2 +} imaging.

Hier, gedetailleerde instructies voor Aequorin gebaseerd luminescentie beeldvorming van weefsel-en stimuli specifieke Ca ^{2 +} dynamiek in Arabidopsis zaailingen, en voor confocale beeldvorming van cytosol en nucleaire Ca presenteren we ^{2 +} dynamiek in Arabidopsis wortel cellen die zaak 12 luminescentie beeldvorming van FAS uiten kan worden aangepast aan de stress geïnduceerde Ca2 ⁺ dynamiek analyseren intacte planten of weefsels hier niet beschreven, of aan gemutageniseerde Arabidopsis plantpopulaties screenen voor mutanten met veranderde stress veroorzaakte Ca ^{2 +-signalen.} De live cell Ca ^{2 +} imaging setup kan worden aangepast aan Ca analyseren2+ dynamiek binnen de verschillende subcelluar compartimenten of in verschillende celtypes met andere Ca ^{2 +-indicatoren.}

Protocol

1 Aequorin Based Ca 2 + Imaging Met behulp van de FAS-systeem Bereid zaailingen voor luminescentie beeldvorming. Steriliseren zaden van Arabidopsis planten die Aequorin met 10% bleekwater oplossing met 0,01% Triton-100. Zaai de steriele zaden op een vierkante plaat (10 x 10 cm vierkante Petrischaal met rooster) met volle sterkte MS (Murashige en Skoog basaal zoutmengsel), 1% sucrose en 1,2% agar. Plaats platen verticaal in een groeikamer na stratificatie bij 4 ° C gedurende 2 dagen (Figuur…

Representative Results

Mannitol, NaCl en H 2 O 2 werden gebruikt als proxies voor uitdroging, zout en oxidatieve stress stimuli, respectievelijk. Om te controleren of de zware metaalionen CU2 + synergie met een van deze drie stressstimuli vergeleken we de Ca2 + voor iedere stimuli in de aanwezigheid of afwezigheid van Cu2 +. Zoals getoond in figuur 2, FAS luminescentiebeeldvorming gebleken dat Arabidoposis zaailingen anders reageerde op uitdroging, zout en oxidatieve stre…

Discussion

We hebben een FAS-systeem gedemonstreerd voor het opnemen van de ruimtelijke en temporele Ca2 ⁺ respons van Arabidopsis zaailingen. Deze FAS Ca2 ⁺ opnamesysteem een eenvoudige, gevoelige en robuuste benadering die kan worden aangepast voor het meten Ca2 ⁺ dynamica veroorzaakt door verschillende stimuli naast de abiotische stress stimuli die hier worden gepresenteerd. Met behulp van dit systeem kunnen we gemakkelijk weefsel-of stimuli-specifieke ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +} …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG