Imaging intracellulare Ca²⁺ Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Gli astrociti sono cellule gliali onnipresenti e abbondanti del cervello. E 'ben noto che gli astrociti servono di sostegno vitale e ruoli omeostatici, tra cui il buffering di K ⁺ concentrazione nello spazio extracellulare, l'assorbimento di neurotrasmettitori oltre a fornire le sostanze nutritive. Tuttavia, studi recenti dimostrano che anche la visualizzazione [Ca ^2+] _i segnali, che si verificano spontaneamente e sono aumentate di attività neuronale ^1. L'esistenza di astrociti [Ca ^2+] _i segnalazione è stata sempre più pensato per innescare la loro comunicazione con i neuroni, e come tale è stato interpretato come una forma di "Ca ²⁺ eccitabilità" all'interno di astrociti. I dati disponibili nel corso degli ultimi due decenni suggeriscono due ambienti in cui gli astrociti e neuroni possono comunicare, forse in maniera bidirezionale. In primo luogo, gli astrociti spesso rispondono con un aumento della [Ca2 ^+] _i, quando attivato da neurotrasmettitori eneuromodulatori rilasciati dai neuroni ^2. In secondo luogo, [Ca ^2+] _i accresce in astrociti causare il rilascio di molecole di segnalazione da astrociti, che a loro volta possono influenzare i neuroni e vasi sanguigni. L'evidenza suggerisce che molecole rilasciate dagli astrociti portano a cambiamenti nelle funzioni delle sinapsi, circuiti e in ultima analisi il comportamento ^3-5 tramite segnalazione astrociti-to-neurone. Tuttavia, questo rimane un settore di ricerca in rapido sviluppo, e si è sostenuto che una migliore e dettagliata comprensione di astrociti [Ca ^2+] _i è necessaria per risolvere alcune delle attuali incertezze ^6.

Nel lavoro passato, è stato dimostrato che grosso carico di organici Ca ^{2 +} indicatore coloranti in astrociti non riesce a rilevare in modo affidabile [Ca ^2+] _i segnali all'interno intere astrociti in coltura e in situ ^7-10. Questi risultati sono stati discussi da noi e altri ^6,11,12. Il Emerging quadro è che [Ca ^2+] _i segnali all'interno dei processi di astrociti (ad esempio, rami e ramoscelli), che sono i siti principali per le interazioni con i neuroni e vasi sanguigni, sono stati raramente esplorato in dettaglio. Recentemente, l'uso di indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) come GCaMP3 citosolica, GCaMP5G e GCaMP6 e membrana plasmatica versioni tethered (ad esempio, Lck-GCaMP3) ha permesso lo studio di [Ca ^2+] _i segnali in piccoli scomparti di astrociti tali processi sottili, vicino alla membrana plasmatica ed entro interi territori ^7,8. Tuttavia, GECIS hanno uno svantaggio negli organici Ca ²⁺ indicatore coloranti e che è il requisito per i metodi genetici per fornire i geni che codificano selettivamente ai astrociti in vivo per periodi di settimane per il GECIS di essere adeguatamente espresso. Espressione in vivo è tipicamente realizzato utilizzando topi transgenici, knock-in topi o con virus a base di consegna appscarafaggi. Nel presente articolo Giove riportiamo i metodi e le procedure utilizzate per fornire GECIS di astrociti striatali che utilizzano virus adeno-associati. Facciamo il cito-GCaMP3 come esempio, ma la stessa procedura di base funziona per qualsiasi altra GECI o fluorescenti giornalista base di proteine.

Protocol

Tutti i protocolli di animali erano in accordo con la US National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso la UCLA. 1.1) Preparare Micropipette e AAV2 / 5 Virus Loading Utilizzare sottili micropipette di vetro borosilicato per l'iniezione del virus. Tirare la micropipetta utilizzando un programma che tira in due fasi con un estrattore verticale. Smusso l…

Representative Results

Per astrociti espressione specifica del cito-GCaMP3 nello striato, abbiamo usato il virus adeno-associato (AAV) del sierotipo 5, e la GFAP GfaABC 1 D promotore (Figura 1A), che è stato precedentemente dimostrato da guidare robusta GCaMP3 e gene reporter espressione in ippocampo e astrociti corticali 8,14. Due settimane dopo microiniezione virus nello striato del mouse, il mouse (~ 10 settimane) è stato perfuso e IHC è stata eseguita su sezioni di cervello sottili per valutare l&…

Discussion

I metodi qui descritti hanno permesso di esprimere cito-GCaMP3 negli astrociti striatali in vivo per la successiva [Ca ^2+] _i di imaging in situ. Questo metodo presenta vantaggi rispetto utilizzando transgenici o topi knock-in, compreso robusta espressione della proteina bersaglio, rapidità e flessibilità di implementazione sperimentale e specificità anatomica. L'espressione di GCaMP3 utilizzando AAV2 / 5 è risultato essere specifico e robusto. La combinazione di GFAP GfaAB…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000