이미징 세포 내 칼슘^{2 +} 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

성상 세포는 뇌의 유비쿼터스와 풍부한 신경 교세포 있습니다. 그것은 잘 성상 세포가 중요한 지원 및 세포 외 공간에서의 K ⁺ 농도의 버퍼링, 흡수 신경 전달 물질의를 제공 할뿐만 아니라 영양소를 포함 항상성 역할을 역할을한다는 설정됩니다. 그러나, 최근의 연구들은 또한 자연적으로 발생하여 신경 세포의 활동을 ¹ 증가 ^[칼슘] _내가 신호를 표시하는 것을 알 수있다. 성상 세포의 존재는 [칼슘 ^2+] _{I 시그널링} 점점 뉴런과의 통신을 유발하는 것으로 생각되고 있으며, 이와 같이 성상 내의 ^"칼슘 흥분성"의 형태로 해석되었다. 지난 20 년 동안 사용할 수있는 데이터는 성상 세포와 신경 세포는 아마도 양방향 방식으로 통신 할 수있는 두 가지 설정을 제안한다. 첫째, 성상 세포는 종종 _내가 신경 전달 물질에 의해 활성화 ^[칼슘]의 증가로 응답^신경이 해제 신경 조절. 둘째, [칼슘 ^{2 +]} 성상 세포 내에서 _내가 증가는 다시 신경과 혈관에 영향을 미칠 수있는 성상 세포에서 신호 전달 분자의 방출을 야기한다. 증거는 성상 세포에서 방출 분자가 성상 세포 간 신경 신호를 통해 ​​시냅스 회로와 궁극적으로 행동 ^3-5의 기능의 변화로 이어질 것이 좋습니다. 그러나이 급속히 발전 연구 분야 남아 있고, 이는 성상 세포의 더 상세한 이해는 [칼슘 ^2+] _I는 현재의 불확실성 ^(6)의 일부를 해결하기 위해 필요하다고 주장하고있다.

과거의 연구에서,이 성상 세포에 유기 ^칼슘 지표 염료의 대량로드가 확실하게 감지하지 못하는 것을 증명했다 [칼슘 ^{2 +]} 문화 및 현장 ^7-10에서 전체 성상 세포 내에서 _내가 신호. 이러한 연구 결과는 우리와 다른 사람 ^6,11,12에 의해 논의되었다. emerginG 사진은 [칼슘 ^{2 +]} _나는 신경과 혈관과의 상호 작용에 대한 기본 사이트입니다 성상 세포 프로세스 (예를 들면, 지점 및 branchlets) 내에서 신호를 거의 자세히 살펴되어 있지 않은 것입니다. 최근에는 세포질 GCaMP3, GCaMP5G 및 GCaMP6 및 세포막과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 사용이 닿는 버전 (예를 들어, Lck에-GCaMP3)는 성상 세포 등의 작은 구획에 ^[칼슘] _내가 신호의 연구를 허용하고있다 얇은 프로세스, 세포막 근처 전체 지역 ^7,8 내. 그러나 GECIs 유기 칼슘 ^{2 +} 지표 염료를 통해 한 가지 단점을 가지고 GECIs 적절하게 할 표현하는 유전 적 방법은 주 단위로 생체 내에서 성상 세포에 선택적으로 인코딩 유전자를 전달하기 위해 그 요구 사항입니다. 생체 내에서 발현은 일반적으로 노크에 쥐 또는 바이러스를 기반으로 배달 응용 프로그램과 함께, 형질 전환 마우스를 사용하여 달성된다바퀴벌레. 본 조브 기사에서 우리는 아데노 – 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상 세포에 GECIs을 제공하기 위해 사용되는 방법과 절차를보고합니다. 우리는 예를 들어 사이토-GCaMP3에 초점을 동일한 기본 절차는 다른 GECI 또는 형광 단백질 기반 기자 모든 작동합니다.

Protocol

모든 동물 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 미국 국립 연구소에 따라이었고, UCLA에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1.1) 마이크로 피펫 및 AAV2 / 5 바이러스로드 준비 바이러스의 주입을위한 좋은 붕규산 유리 마이크로 피펫을 사용합니다. 수직 풀러와 두 단계 당기는 프로그램을 사용하여 마이크로 피펫을 당깁니다….

Representative Results

줄무늬 체에서 사이토-GCaMP3의 성상 세포 특이 적 발현을 위해, 우리는 이전에 견고 GCaMP3 및 리포터 유전자를 구동하는 도시 된 아데노 – 관련 바이러스 (AAV) 5 혈청 형 및 GFAP GfaABC 한 D 촉진제 (도 1A)를 사용 해마와 대뇌 피질의 성상 세포 8, 14의 식입니다. 2 주 마우스 선조체에 바이러스 미세 주입 한 후, 마우스 (~ 10 주)을 관류하고 IHC는 선조체 (그림 1B)의 ?…

Discussion

여기에 설명 된 방법은 우리가 현장에서 후속 [칼슘 ^{2 +]} _{나는 영상을} 위해 생체 내에서 선조체의 성상 세포에서 사이토-GCaMP3을 표현 할 수있다. 이 방법은 형질 전환 또는 강력한 대상 단백질, 신속성의 표현과 실험적인 구현 및 해부학 적 특이성의 유연성을 포함 노크에서 마우스를 사용하여보다 이점이있다. AAV2 / 5 사용 GCaMP3의 발현은 구체적이고 강력한 것으로 밝?…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000