Изображений внутриклеточный Ca²⁺ Сигналы в полосатом теле астроциты от мышей помощью взрослого генетически закодированные показатели кальция

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Астроциты являются вездесущие и обильные глиальные клетки головного мозга. Хорошо известно, что астроциты служат жизненно важную поддержку и гомеостатическую роль в том числе буферизации концентрации К ⁺ во внеклеточном пространстве, поглощение нейротрансмиттеров, а также обеспечивающих питательных веществ. Тем не менее, последние исследования показывают, что они также отображать [Ca ^2+] _Я сигналы, которые возникают спонтанно и увеличиваются на нейронной активности ^1. Существование астроцитов [Ca ^2+] сигнализация _я все чаще думал, чтобы вызвать их связь с нейронами, и как таковой было истолковано как форма «Са ²⁺ возбудимости» в астроциты. Имеющиеся данные за последние два десятилетия предложить два варианта настройки, в котором астроциты и нейроны могут общаться, возможно, в двунаправленного образом. Во-первых, астроциты часто реагируют с увеличением [Ca2 ^+] _я при активации нейротрансмиттеров инейромодуляторы освобожденные из нейронов ^2. Во-вторых, [Ca ^2+] _{I Увеличивает} пределах астроцитов вызвать высвобождение сигнальных молекул из астроцитов, что, в свою очередь, может повлиять на нейроны и кровеносные сосуды. Опыт показывает, что молекулы, высвобождаемые из астроцитов привести к изменениям в функциях синапсов, схем и, в конечном счете поведение ^3-5 через астроцитов-на-нейрона сигнализации. Тем не менее, это по-прежнему быстро развивается область исследований, и было доказано, что лучше и детальное понимание астроцитов [Ca _^2+], необходимо, чтобы решить некоторые из существующих неопределенностей ^6.

В прошлой работе было показано, что основная погрузка органических Ca ²⁺ индикаторных красителей в астроциты не удается надежно обнаруживать [Ca _^2+] Я сигналы в целых астроцитов в культуре и в месте ^7-10. Эти выводы были обсуждены нами и другими ^6,11,12. Emerginг картина такова, что [Ca _^2+], сигналы в астроцитов процессов (например, филиалов и веточки), которые являются основными местами для взаимодействия с нейронами и кровеносными сосудами, которые редко были изучены подробно. В последнее время использование генетически кодируемых показателей кальция (GECIs), таких как цитозольный GCaMP3, GCaMP5G и GCaMP6 и плазменной мембране привязные версии (например, ЛКК-GCaMP3) позволило изучение [Ca ^2+] _Я сигналов в небольших отсеках астроцитов таких в виде тонких процессы, вблизи плазматической мембране и в течение всей территории ^7,8. Тем не менее, GECIs есть один недостаток над органических Ca ²⁺ индикаторных красителей и это требование генетические методы, чтобы доставить гены, кодирующие избирательно астроцитов в естественных условиях в течение периодов недель для GECIs быть соответствующим образом выразил. Выражение в естественных условиях, как правило, достигается с помощью трансгенных мышей, домино у мышей или с вирусом основан приложение доставкиплотва. В настоящей статье Юпитер мы сообщаем методы и процедуры, используемые для доставки GECIs в полосатой астроциты с помощью аденоассоциированные вирусы. Мы сосредоточены на цито-GCaMP3 в качестве примера, но то же самое основное процедура работает для любой другой Geci или флуоресцентный белок репортера основе.

Protocol

Все протоколы животных были в соответствии с Национальными институтами Руководство здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и были утверждены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Лос-Анджелесе на. 1.1) Подготовка микропипет…

Representative Results

Для астроцитов специфическую экспрессию цито-GCaMP3 в полосатом теле, мы использовали адено-ассоциированный вирус (AAV) от 5 серотипа, и GFAP GfaABC 1 D промотора (Фигура 1А), которое было показано ранее, привод надежную GCaMP3 и ген-репортер выражение в гиппокампе и коры астроцитов 8,1…

Discussion

Методы, описанные здесь, позволили нам высказать CYTO-GCaMP3 в полосатой астроцитов в естественных условиях для последующего [Ca _^2+], визуализации на месте. Этот метод имеет преимущества перед использованием трансгенных или нокаут в мышей, в том числе надежной выражения ?…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000