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Biology

एक वर्णमिति गोल्ड nanoparticle के परख लागू करने के लिए संरचना-स्विचिंग aptamers चुनने के लिए एक विधि

Published: February 28, 2015 doi: 10.3791/52545
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,3, 1, 1
1711th Human Performance Wing, Human Effectiveness Directorate, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 2The Henry M. Jackson Foundation, 3UES, Inc.

Abstract

छोटे अणुओं की वजह से मानव स्वास्थ्य और प्रदर्शन के विभिन्न पहलुओं की बायोमार्कर के रूप में उनके शारीरिक निहितार्थ को biosensing अनुप्रयोगों के लिए अमीर लक्ष्य प्रदान करते हैं। न्यूक्लिक एसिड aptamers तेजी biosensor प्लेटफार्मों पर मान्यता तत्व के रूप में लागू किया जाता है, लेकिन छोटे अणु लक्ष्य की ओर aptamers का चयन विशेष डिजाइन विचार की आवश्यकता है किया गया है। इस काम के संशोधन और छोटे अणु लक्ष्य के लिए संरचना-स्विचिंग aptamers चयन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है एक विधि का महत्वपूर्ण कदम का वर्णन है। चुंबकीय मोतियों पर पूरक डीएनए कब्जा जांच के लिए संकरित एक डीएनए पुस्तकालय से बंधन दृश्यों रचना में एक लक्ष्य प्रेरित परिवर्तन के माध्यम से nonbinders से अलग हो रहे हैं। समर्थन मैट्रिक्स (मोती) बाध्यकारी दृश्यों आगे परिलक्षित नहीं किया जाएगा क्योंकि यह विधि फायदेमंद है, और यह लक्ष्य अणु के स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, पिघलने कब्जा जांच के तापमान और पुस्तकालय, पर या थोड़ा आरटी से ऊपर रखा जाता है इस तरह के दृश्यों टी किऊष्मा के आधार पर टोपी dehybridize भी सतह पर तैरनेवाला समाधान में उपस्थित रहेंगे। यह प्रभावी रूप से (nonbinders दृश्यों से बाध्यकारी अलग लक्षित करने की क्षमता) विभाजन दक्षता की सीमा है, और इसलिए कई चयन राउंड पृष्ठभूमि दृश्यों को हटाने के लिए आवश्यक हो जाएगा। रिपोर्ट की विधि के कारण नकारात्मक चयन कदमों के कार्यान्वयन, सरलीकृत संवर्धन निगरानी, ​​और बढ़ाया तंगी प्रदान करने के लिए चयन संवर्धन निम्नलिखित कब्जा जांच की लंबाई का विस्तार करने के लिए पिछले संरचना-स्विचिंग aptamer चयन से अलग है। चयनित संरचना-स्विचिंग aptamers aptamer के गठनात्मक परिवर्तन द्वारा एक लक्ष्य अणु की उपस्थिति की रिपोर्ट है कि एक सोने nanoparticle परख मंच में फायदेमंद हैं। यह एक नैदानिक ​​या तैनात वातावरण में लाभकारी है कि एक सरल, तेजी से वर्णमिति readout के प्रदान करता है, क्योंकि सोने nanoparticle परख लागू किया गया था। डिजाइन और अनुकूलन विचार सबूत की सिद्धांत रूप में परख के लिए प्रस्तुत कर रहे हैंबफर में ई काम शारीरिक तरल पदार्थ में छोटे अणु biosensing की ओर काम के आगे विस्तार के लिए एक आधार प्रदान करने के लिए।

Introduction

छोटे अणुओं लंबे समय से इस तरह के शारीरिक विषाक्तता या पोषण, सेल संकेतन, और रोग एक के रूप में दवा उपचार के रूप में विविध जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है के रूप में मान्यता दी गई है। विभिन्न छोटे अणुओं भी तनाव 2,3, थकान 4, और रोग 5 सहित शारीरिक स्थितियों का संकेत बायोमार्कर के रूप में सुझाव दिया गया है। उदाहरण के लिए, ऊंचा कोर्टिसोल के स्तर में कमी आई शारीरिक प्रदर्शन और अन्य स्वास्थ्य की स्थिति में 6-8 में हो सकता है, जो तनाव के साथ सहसंबंधी। इसी तरह, लार में कुछ पेप्टाइड्स के अनुपात में बदलाव शारीरिक अभिव्यक्तियाँ एकाग्रता की कमी, बिगड़ा प्रतिक्रिया समय, और कम संज्ञानात्मक समारोह 4 शामिल हैं, जहां थकान के भविष्य कहनेवाला हैं। इसलिए, छोटे अणुओं के स्तर की निगरानी करने के लिए लक्ष्य-विशिष्ट biosensors के विकास के एक व्यक्ति के स्वास्थ्य और प्रदर्शन क्षमताओं का आकलन करने के लिए एक अमूल्य मीट्रिक प्रदान कर सकता हैidual।

ऐतिहासिक, छोटे अणु का पता लगाने श्रम प्रधान जुदाई तकनीक के द्वारा या प्रतिरक्षी आधारित मान्यता 6,7 द्वारा प्रदर्शन किया गया है। हाल ही में, न्यूक्लिक एसिड aptamers 9,10 विशिष्ट अनुप्रयोगों में एंटीबॉडी से अधिक विशिष्ट लाभ के अधिकारी मान्यता है कि तत्व के रूप में उभरा है। 12 ऊतकों को धातु आयनों 11 से आकार में बदलती एक लक्ष्य बाध्य करने के लिए उनकी क्षमता के साथ, aptamers व्यापक रूप से biosensing प्लेटफार्मों 13,14 में मान्यता तत्व के रूप में लागू किया गया है। एंटीबॉडी की तुलना में, aptamers रासायनिक संश्लेषित है, और यह सतह स्थिरीकरण या रिपोर्टिंग के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रासायनिक संशोधनों के लागू करने के लिए इसलिए सरल है कर रहे हैं। एंटीबॉडी शारीरिक स्थितियों 15,16 तक सीमित हैं, जबकि aptamers, प्रयुक्त चयन शर्तों को संशोधित करके वांछित शर्तों के तहत उच्च लक्ष्य विशिष्टता से चयनित किया जा सकता है। इसके अलावा, aptamers वें की वजह से उच्च ligand के घनत्व में सक्षम हैंएक biosensor मंच पर दक्षता संकेत उच्च लक्ष्य है, जिसके परिणामस्वरूप छोटे आकार EIR, और aptamers का बढ़ाया स्थिरता दोहराया उपयोग और लंबे समय तक सेंसर भंडारण 16 के लिए अनुमति देता है।

Aptamers दृश्यों की एक शुरुआती पुस्तकालय लक्ष्य अणु बाध्य करने के लिए क्षमता के साथ कई (10 1 -10 2) दृश्यों से युक्त एक समृद्ध अंतिम पूल करने के लिए 10 से 13 -10 15 अद्वितीय अणुओं से विकसित किया है जिसमें SELEX, के रूप में जाना एक प्रक्रिया का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं। अंतिम समृद्ध पूल फिर अनुक्रम है, और पृथक्करण स्थिरांक (कश्मीर घ) लक्ष्य अणु के साथ उच्चतम प्रतिलिपि संख्या दृश्यों के assays के बंधन से प्राप्त कर रहे हैं। एक अंतिम समृद्ध आबादी के लिए पूल का विकास अधिक से अधिक संवर्धन प्राप्त किया जाता है, जब तक हर दौर में लक्ष्य बाध्यकारी पूल के प्रतिशत की निगरानी के द्वारा पता लगाया है। यह बाध्यकारी दृश्यों nonbinders और ampl से विभाजित कर रहे हैं, जहां विकासवादी दौर के एक नंबर, पर जगह लेता हैपोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग ified। प्रभावी ढंग से बाँधने विभाजन और बनाए रखने की क्षमता के चयन और सीधे प्रभाव चयनित aptamers 15 की विशेषताओं की दक्षता का मुख्य निर्धारकों में से एक है। वे आकार या प्रोटीन लक्ष्य 1,15 के विभाजन की प्रक्रिया में सहायता कि कार्य समूहों की विविधता के पास नहीं है के बाद से SELEX विभाजन चरण छोटे अणुओं के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण है। उदाहरण के लिए, कई प्रोटीन विभाजन प्लेटफार्मों हालांकि बाध्य डीएनए-छोटे अणु लक्ष्य परिसरों के गुणों को अप्रभावी विभाजन एक है, जिसके परिणामस्वरूप आम तौर पर nonbinding दृश्यों की तुलना में काफी अलग नहीं कर रहे हैं, आकार या आरोप-आधारित जुदाई पर भरोसा करते हैं। वैकल्पिक SELEX विभाजन के तरीकों संभवतः एक छोटे अणु के बंधन विशेषताओं में परिवर्तन है, जो स्थिरीकरण या लक्ष्य की लेबलिंग शामिल हो सकता है। छोटे अणु आर लक्ष्यों के लिए नतीजतन, एक चयन प्रक्रिया के डिजाइन aptamers उत्पन्न करने के लिएविशेष विचार equires।

संशोधनों की एक किस्म है, प्रक्रिया के विभाजन की दक्षता बढ़ाने के अंतिम पूल में दृश्यों की आत्मीयता या विशिष्टता में सुधार, या विभिन्न अनुप्रयोगों 15,16 करने के लिए इसे और अधिक उत्तरदायी बनाने के लिए मूल SELEX पद्धति को लागू किया गया है। छोटे अणुओं के लिए चयन करने में सक्षम एक SELEX संशोधन लक्ष्य अणु 17,18 के साथ बातचीत पर एक गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना है कि संरचना-स्विचिंग aptamers, या aptamers उत्पन्न करने के लिए डिजाइन किया गया था। इस पद्धति का एक उदाहरण में, पुस्तकालय चुंबकीय मोतियों 17 पर स्थिर nonbinding पूरक डीएनए के एक छोटे टुकड़े (सीडीएनए) संकरित है। लक्ष्य बाध्यकारी होने पर nonbinders सीडीएनए संकरित जबकि शेष, बंधन दृश्यों के गठनात्मक परिवर्तन / मोती चुंबकीय विभाजित और खारिज कर रहे हैं, सतह पर तैरनेवाला समाधान में उन्हें रिहा, सीडीएनए से dehybridize करने के लिए उन्हें सक्षम बनाता है। इस विधि के लाभ हैtageous छोटे अणुओं के लिए यह जुदाई को प्राप्त करने के लक्ष्य अणु का स्थिरीकरण या लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है क्योंकि।

संरचना-स्विचिंग करने में सक्षम हैं कि aptamers एक लक्ष्य अणु की उपस्थिति का पता लगाने के लिए aptamer संरचना में बदलाव की आवश्यकता है कि किसी भी संभावित biosensor प्लेटफॉर्म के लिए एक मूल्यवान सुविधा के पास है। विशेष रूप से, aptamers नमक चुनौती 19,20 के बाद लक्ष्य अणु की उपस्थिति में एक वर्णमिति प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए संरचना-स्विचिंग सिद्धांत पर आधारित है कि समारोह assays के बनाने के लिए सोने के नैनोकणों (AuNPs) के साथ जोड़ा जा सकता है। एक AuNP परख में, एकल असहाय डीएनए (ssDNA) aptamer शुरू में AuNP सतह के लिए adsorbs और नमक चुनौती से बचाता है। लक्ष्य की मौजूदगी नमक इसके बाद एक लाल-टू-नीले रंग बदलने में जिसके परिणामस्वरूप, AuNP सतह को उजागर करता है कि aptamer में एक गठनात्मक परिवर्तन लाती है। AuNP assays के भी संकेत है, जहां micromolar आत्मीयता aptamer बढ़ाना दिखाया गया हैएस हदबंदी लगातार (कश्मीर डी) 21 से कम परिमाण के स्तर के आदेश पर लक्ष्य का पता लगाने कर सकते हैं। यह सुविधा समानताएं आम तौर पर कम micromolar से millimolar सांद्रता 1,15 करने के लिए सीमा जहां छोटे अणु लक्ष्य, के लिए विशेष रूप से आकर्षक है। आम तौर पर, परख biosensor का पता लगाने के प्लेटफॉर्म के रूप में aptamer-AuNP assays के आगे के अध्ययन को प्रोत्साहित करने, प्रदर्शन करने के लिए भी तेजी से और अपेक्षाकृत सरल है।

इस काम के लक्ष्य के लिए एक प्रतिनिधि अणु के रूप में तनाव मार्कर कोर्टिसोल का उपयोग कर biosensing अनुप्रयोगों के लिए छोटे अणुओं की संरचना-स्विचिंग aptamers के चयन के लिए एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। एक AuNP biosensor का पता लगाने के योजना की वजह से आपरेशन और वर्णमिति readout की अपनी सादगी के लिए ब्याज की है, लेकिन संरचना-स्विचिंग aptamers ऐसे भी aptamer conformatio में एक परिवर्तन के माध्यम से पता लगाने प्रदान करते हैं कि विद्युत रासायनिक 22 या प्रतिदीप्ति 23 के रूप में वैकल्पिक संवेदन मंच outputs है, को लागू कर रहे हैंलक्ष्य पर एन बाध्यकारी। पिछले विधियों की तुलना में, कई नकारात्मक चयन चरणों डिजाइन 17,18 में शामिल थे, और एक साधारण यूवी-आधारित संवर्धन का पता लगाने स्कीम (चित्रा 1) लागू किया गया था। इस प्रोटोकॉल विरासत विधियों 17 में इस्तेमाल किया radioligand संवर्धन का पता लगाने के योजना के साथ विपरीत में है। प्रस्तावित विधि को भी अधिक से अधिक संवर्धन 24 मनाया गया के बाद धुन को प्रभावी ढंग से चयन की तंगी विभाजन दक्षता बढ़ाने के लिए और करने के लिए चयन में इस्तेमाल सीडीएनए कब्जा जांच की लंबाई में वृद्धि शामिल है। tuned तंगी अंतिम पूल में लक्ष्य से eluted डीएनए के एक कम कुल प्रतिशत का कारण है, लेकिन एक पहले दौर से उच्चतम प्रतिलिपि संख्या अनुक्रम की तुलना में बढ़ाया आत्मीयता के साथ ही एक दृश्य है कि के उच्च प्रतिलिपि संख्या में हुई। अंतिम पूल से उच्चतम प्रतिलिपि संख्या अनुक्रम अनुक्रम एक मंच करने के लिए उत्तरदायी था कि बताने के लिए एक AuNP परख करने के लिए लागू किया गया थाकि बाध्यकारी लक्ष्य इंगित करने के लिए एक संरचनात्मक परिवर्तन की आवश्यकता है। इस बफर आधारित परख AuNP परख की प्रतिक्रिया सतह पर लागू डीएनए के घनत्व को बदलने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है कि पता चलता है, और सबूत की सिद्धांत काम में छोटे अणु aptamer आधारित AuNP biosensors के विकास की ओर भविष्य के अनुसंधान के प्रयासों को समर्पित करने के लिए के रूप में कार्य करता है शारीरिक तरल पदार्थ।

Protocol

1. पुस्तकालय और प्राइमर डिजाइन और संश्लेषण

  1. प्रारंभिक पुस्तकालय और प्राइमरों (इस विषय को पिछले प्रकाशनों में बड़े पैमाने पर समीक्षा की गई है) 25,26 डिजाइन।
    1. मानक phosphoramidite रसायन विज्ञान का उपयोग कर इस अध्ययन के लिए निम्नलिखित दृश्यों synthesize:
      पुस्तकालय: GAATGGATCCACATCCATGG-एन 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
      आगे प्राइमर: GGAATGGATCCACATCCATGG
      रिवर्स प्राइमर: बायोटिन AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA
    2. पुस्तकालय की 5'क्षेत्र के पूरक होने के लिए सीडीएनए कब्जा जांच डिजाइन। एक बढ़ा तापमान के पिघलने की आपूर्ति प्रत्येक बाद बेस के साथ, थोड़ा आरटी ऊपर एक पिघलने के तापमान प्रदान करने के लिए ऑनलाइन पिघलने के तापमान सॉफ्टवेयर का विश्लेषण द्वारा प्रारंभिक लंबाई चुनें।
      मेर कैद जांच: CCATTCC बायोटिन
      मेर कैद जांच: TCCATTCC बायोटिन
      मेर कैद जांच: ATCCATTCC बायोटिन
  2. मानक HPLC द्वारा पुस्तकालय शुद्ध। Desalting suffi हैप्राइमरों और कब्जा जांच के लिए cient। ऊपर के लिए कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर वांछित एकाग्रता और दुकान पर nuclease मुफ्त पानी में oligonucleotides के पुनर्गठन।

2. बफर, पुस्तकालय, और नमूना तैयार

  1. Millipore या 50 मिमी Tris, 137 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 MgCl, 7.4 पीएच की सांद्रता के साथ Nuclease मुक्त ग्रेड पानी में बफर के 500 मिलीलीटर तैयार करें। एक बाँझ 0.2 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से बफर फ़िल्टर; भंडारण महीनों के लिए परिवेश की स्थिति में संभव है।
    1. वैकल्पिक रूप से, इस तरह के, आदि पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा), HEPES (4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड) के रूप में अन्य बफ़र्स का उपयोग
  2. दो thermomixers सेट करें; 95 डिग्री सेल्सियस के लिए एक सेट और परिवेश की स्थिति (इस काम में ~ 20 डिग्री सेल्सियस) पर अन्य रहते हैं। एक बर्फ बाल्टी तैयार करें।
  3. हीट / 100 μl पुस्तकालय रखकर डीएनए पुस्तकालय शांत तस्वीर (~ 10 से 15 -10 16 दृश्यों के लिए 2.5 nmol) thermomixer में सेट5 मिनट के लिए टी 95 डिग्री सेल्सियस। चुंबकीय मोती (वर्गों 3.1-3.6) तैयार कर रहे हैं, जबकि बर्फ पर ट्यूब रखें। Λ = 260 एनएम यूवी अवशोषण द्वारा डीएनए पुस्तकालय की वास्तविक एकाग्रता का निर्धारण और पुस्तकालय के लिए उपयुक्त रूपांतरण कारक आवेदन।
  4. लक्ष्य विलेयता के लिए एक माध्यम उपयुक्त में लक्ष्य शेयर समाधान तैयार करें।
    1. DMSO में 100 मिमी विश्लेष्य शेयरों तैयार करें। परिवेश की स्थिति में संग्रहीत है, लेकिन अलग-अलग लक्ष्य अलग गिरावट प्रोफाइल को प्रदर्शन करेंगे जब इन शेयरों लगभग एक महीने के लिए सक्षम हैं।

चुंबकीय मोती और चुनाव के प्रारंभिक दौर के 3. तैयारी

  1. भंवर 6.7 एक्स 10 8 मोती / एमएल streptavidin लेपित चुंबकीय माला और एक नया microcentrifuge ट्यूब 400 μl को हटा दें। 2 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब प्लेस और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  2. बाध्यकारी बफर, vortexing के 400 μl जोड़ने, और रखने के बाद सतह पर तैरनेवाला aspirating द्वारा मोती धो लेंचुंबक पर ट्यूब मोती अलग करने के लिए। इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएँ।
  3. 50 माइक्रोन (अंतिम) पर कब्जा जांच के साथ 400 μl बाध्यकारी बफर में मोती resuspending और परिवेश की स्थिति में thermomixer पर कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए incubating द्वारा चुंबकीय मोतियों पर कब्जा जांच स्थिर।
  4. मुक्त कब्जा जांच दूर करने के लिए खंड 3.2 में वर्णित धोने कदम दोहरा द्वारा मोती बाध्यकारी बफर के 400 μl के साथ तीन बार धोएं।
  5. बाध्यकारी बफर के 400 μl में मोती Resuspend। अगले कदम के लिए मनका समाधान के 100 μl निकालें, और तीन सप्ताह की एक अधिकतम के लिए आगे चयन राउंड के लिए उपयोग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष 300 μl बरकरार रहती है।
  6. खंड 3.2 में वर्णित के रूप में बाध्यकारी बफर के 200 μl के साथ दो बार मोती धो लें।
  7. धोया मोतियों के लिए खंड 2.3 से तस्वीर के 100 μl डीएनए ठंडा जोड़ें और परिवेश की स्थिति में thermomixer का उपयोग कर कोमल आंदोलन के साथ 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    एनOTE: पहले दौर में डीएनए सांद्रता अद्वितीय दृश्यों सैद्धांतिक रूप से मौजूद हैं, जहां पहले दौर में अनुक्रम नुकसान को कम करने के बाद के दौर की तुलना में अधिक हैं।
  8. खंड 2.3 में के रूप में यूवी अवशोषण का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला में डीएनए quantitate और मोतियों के लिए बाध्य डीएनए की मात्रा का आकलन करने के लिए खंड 3.7 में जोड़ा प्रारंभिक राशि से इस घटाना।
    1. 200 μl परिवेश की स्थिति में 5 मिनट के लिए एक thermomixer पर कोमल आंदोलन के साथ बफर बंधन के साथ दो अतिरिक्त washes के द्वारा पीछा बाध्यकारी बफर 200 μl के साथ मोती धो लें।
  9. बफर बंधन में पतला 100 माइक्रोन लक्ष्य के 200 μl में मोती resuspend, और परिवेश की स्थिति में 30 मिनट के लिए thermomixer पर बारी बारी से। लक्ष्य और नियंत्रण में समय के साथ जलीय समाधान के बाहर एकत्र करने के लिए मनाया गया, क्योंकि पूर्व चयन करने के लिए प्रत्येक दिन की शुरुआत में काम कर समाधान ताजा तैयार करें। लक्ष्य-eluted अनुक्रम में शामिल है जो सतह पर तैरनेवाला समाधान को बनाये रखेंआगे के अध्ययन के लिए एस।
  10. खंड 3.8.1 में तैयार मोतियों के लिए 1 माइक्रोन प्रोजेस्टेरोन के 200 μl जोड़कर 1-2 दौर के पूरा होने के बाद नकारात्मक चयन प्रदर्शन करते हैं। परिवेश की स्थिति में thermomixer पर 30 मिनट के लिए धीरे से मिलाने।
  11. मोती कब्जा और धारा 3.9 में के रूप में पूर्व कोर्टिसोल इसके अलावा करने के लिए बाध्यकारी बफर के 200 μl में दो बार मोती धोने, सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए चुंबकीय स्टैंड का प्रयोग करें।

4. संवर्धन मॉनिटरिंग, पीसीआर, और एकल असहाय डीएनए पीढ़ी

  1. चयन संवर्धन की निगरानी के लिए एक डायलिसिस कैसेट के लिए सतह पर तैरनेवाला समाधान जोड़ें। डायलिसिस कोर्टिसोल मौजूद है क्योंकि डीएनए की तुलना में बहुत उच्च सांद्रता में eluted डीएनए से कोर्टिसोल दूर करने के लिए आवश्यक है, और भी मानक डीएनए यूवी λ अधिकतम = 260 एनएम overlaps कि एक यूवी अवशोषण शिखर है।
    1. इस कदम के चयन के शुरुआती दौर में हर दूसरे दौर (राउंड 2, 4, 6, और 8) प्रदर्शन करते हैं। यह नमूना लॉस mitigatesप्रत्येक दृश्य के संभावित कुछ प्रतिलिपि संख्या वर्तमान (उच्चतम विविधता) कर रहे हैं। तेजी से परिणाम के लिए, इस तरह के आकार अपवर्जन स्तंभों के रूप में वैकल्पिक तरीके के रूप में अच्छी तरह से उपयोग किया जा सकता है।
  2. दो बार परिवेश की स्थिति में दो घंटे के लिए बाध्यकारी बफर के ताजा 250 मिलीलीटर में नमूने के साथ कैसेट dialyze। बफर बदलें और 4 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
  3. लक्ष्य से eluted डीएनए का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा dialyzed पूल विश्लेषण (धारा 3.8 के परिणामों से तुलना करें)।
  4. / वी ethidium ब्रोमाइड डब्ल्यू 1% के साथ एक 3% agarose जेल तैयार करें। इस काम में, agarose के 1.5 ग्राम, Tae बफर (40 मिमी Tris एसीटेट, 1 मिमी EDTA, पीएच = 8.0) के 50 मिलीलीटर, और ethidium ब्रोमाइड के 10 μl से एक जेल तैयार करते हैं।
  5. ~ 5-15 चक्र का उपयोग करते हुए एक छोटे पैमाने पर पीसीआर (5 एक्स 50 μl aliquots के) प्रदर्शन से dialyzed पूल साइकिल-अनुकूलन। पीसीआर घटकों के लिए, 1x पीसीआर प्रतिक्रिया बफर (सभी अंतिम सांद्रता), 200 माइक्रोन dNTPs, डीएनए टेम्पलेट का 10% प्रतिक्रिया मात्रा, 500 एनएम प्रत्येक प्राइमर, और 2.5 का उपयोगयू पोलीमर्स (2.5 यू / μl शेयर)।
    1. भागो पीसीआर, 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर शर्तों अनुकूलित 95 डिग्री सेल्सियस (30 सेकंड), 55 डिग्री सेल्सियस (30 सेकंड) के दोहराया चक्रों के बाद, और 72 डिग्री सेल्सियस (1 मिनट), तो एक 72 डिग्री सेल्सियस (10 का उपयोग मिनट) अंतिम विस्तार और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    2. तुलना के लिए एक 25 बीपी मानक सीढ़ी को रोजगार और एक जेल इमेजर पर कल्पना। अवांछित द्वारा उत्पादों के बिना सही आकार मार्कर पर उच्चतम तीव्रता बैंड है कि उत्पादन चक्रों की संख्या का चयन करें।
    3. 6x ब्लू / ऑरेंज लोड हो रहा है डाई के 2 μl के साथ प्रत्येक पीसीआर चक्र के 10 μl के संयोजन, और कदम 4.4 (45 मिनट के लिए 125 वी) में तैयार 3% agarose जेल के 5 अलग कुओं में लोड करके चक्र अनुकूलन के परिणामों का विश्लेषण करें।
  6. खंड 4.5 में निर्धारित शर्तों और उचित चक्र संख्या के उपयोग के एक बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। आमतौर पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं के 6-8 मिलीलीटर इस चयन में प्रत्येक दौर के लिए इस्तेमाल किया 1-2.5 nmol प्राप्त करने के लिए आवश्यक थे। सरल करने के लिए 8-पट्टी ट्यूब का उपयोग करेंआवश्यक कई ट्यूब की हैंडलिंग पीसीआर प्रवर्धन के लिए यह मात्रा विभाज्य।
  7. खंड 4.4 में वर्णित के रूप में एक 3% agarose जेल तैयार करें, और पीसीआर उत्पाद बैंड वर्गों 4.5.2-4.5.3 के चरणों का पालन सही स्थान पर प्रतीत होता है कि मान्य है।
  8. नीचे दिए गए चरणों द्वारा एकल असहाय डीएनए के लिए खंड 4.7 से पूरे डबल असहाय डीएनए उत्पाद कन्वर्ट:
    1. Frits द्वारा अवरुद्ध एक छोटे से कॉलम को streptavidin लेपित मोती (चुंबकीय नहीं) के 300 μl जोड़ें। 5 मिलीलीटर एक luer ताला सिरिंज संलग्न और सवार को कोमल दबाव लागू करने से बाध्यकारी बफर के साथ मोती धो लें। स्तंभ से सिरिंज निकालें और मोती सवार आकांक्षा से परेशान नहीं हैं तो प्रत्येक सामग्री के अलावा के बाद सिरिंज बंद लाइन से सवार को हटा दें।
    2. पीसीआर उत्पाद जोड़ें और सवार पर कोमल दबाव का उपयोग कॉलम के माध्यम से इसे पारित। पीसीआर उत्पाद के लिए कोई और अधिक 1-1.2 से मिलीलीटर प्रत्येक स्तंभ में जोड़ा जाता है कि इस तरह के कई कॉलम का प्रयोग करें। अंतिम FL त्यागेंओउ के माध्यम से डीएनए के बाद विरोधी भावना कतरा पर बायोटिन आधा भाग द्वारा स्तंभ पर बनाए रखा जाएगा।
    3. बफर बाध्यकारी 5 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें।
    4. 0.2 एम NaOH के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर डीएनए Dehybridize। यह एकल असहाय समझ में डीएनए होता है के रूप में eluate को बनाये रखें।
  9. Nuclease मुफ्त पानी के साथ एक धोने के द्वारा तैयार एक desalting स्तंभ के लिए 0.5 मिलीलीटर जोड़कर 0.2 एम NaOH में ssDNA फीका बनाना। फिर 1 मिलीलीटर nuclease मुफ्त पानी जोड़ने के लिए और इस desalted ssDNA नमूना इकट्ठा, प्रारंभिक 0.5 मिलीलीटर तरल पदार्थ त्यागें। कई desalting स्तंभों के उपयोग के प्रत्येक 0.5 मिलीलीटर हिस्से के लिए आवश्यक हो जाएगा।
    1. Λ = 260 एनएम यूवी अवशोषण द्वारा eluted डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण।
    2. वैक्यूम नमूना सूखी और बाध्यकारी बफर का एक उचित मात्रा में पुनर्गठित। चयन के अगले दौर के लिए प्राप्त की पर्याप्त डीएनए वहाँ नहीं था, वर्गों 4.6-4.9.2 दोहराएँ।

चयन और अनुक्रमण के 5. बाद के दौर

  1. संवर्धन निगरानी (धारा 4.1) के परिणामों के आधार पर चयन की स्थिति की तंगी समायोजित करें। आम तौर पर, पूल से उच्चतम आत्मीयता बांधने की मशीन का चयन करने के क्रम में लगातार चयन राउंड में स्थिति और अधिक कठोर बनाने के।
    नोट: यह नकारात्मक चयन यौगिक की एकाग्रता, या अन्य तरीकों 27 की एक किस्म में वृद्धि का लक्ष्य एकाग्रता कम, डीएनए एकाग्रता बढ़ाने धोने कदम की संख्या, समय, या मात्रा में वृद्धि का एक संयोजन शामिल सकता है।
    1. लक्ष्य अणु के लिए दृश्यों की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त के रूप में उचित नियंत्रण लागू करें। इस काम में, प्रणाली (तालिका 1) गोल तीन में शुरुआत और चयन के दौरान एकाग्रता में वृद्धि करने के लिए एक नकारात्मक चयन अणु (प्रोजेस्टेरोन) लागू होते हैं। दौर 11 में शुरू, 10-20 माइक्रोन प्रोजेस्टेरोन पूर्व (धारा 3.7 से पहले) मनकों पर स्थिरीकरण करने के साथ 30 मिनट के लिए डीएनए पूल पूर्व सेते हैं। अधिक से अधिक संवर्धन मनाया जाता है के बाद कब्जा जांच की अवधि बढ़ाएं।
  2. संगत प्राइमरों और एक उच्च निष्ठा पोलीमर्स के साथ पीसीआर प्रवर्धन द्वारा अनुक्रमण के लिए ज़्यादा से ज़्यादा समृद्ध (गोल 13) और न्यूनतम समृद्ध (दौर 6) की स्थिति का प्रतिनिधित्व अंतिम पूल (गोल 15) और अन्य पूल तैयार करें।
    1. 1x (प्रतिक्रिया बफर) के अंतिम सांद्रता का उपयोग कर एक 50 μl प्रतिक्रिया मात्रा 200 माइक्रोन (प्रत्येक dNTP), 400 एनएम (प्रत्येक प्राइमर), डीएनए पूल के 0.5 μl, और पोलीमर्स के 0.5 μl सेट करें। साइकिल अंतिम विस्तार के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक 7 मिनट पकड़ के अपवाद के साथ एक ही पीसीआर शर्तों का उपयोग खंड 4.5 में उल्लिखित चरणों का उपयोग दौर से प्रत्येक के लिए अनुकूलन।
    2. अच्छी तरह से गैर चिपकने की चादर के साथ सील टोपियां के साथ microcentrifuge ट्यूब में एक अनुक्रमण सुविधा के लिए तैयार पूल के 50 μl भेजें। बुलबुला लपेटो और जहाज ओ / एन अनुक्रमण सुविधा के लिए आइस पैक के साथ साथ पैक एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ट्यूब रखें।
    3. अनुक्रम पूल (एस) के संवर्धन का आकलन करने के लिए प्रत्येक दृश्य की नकल संख्या निर्धारित करते हैं।
      1. अनुक्रमण सुविधा के द्वारा आपूर्ति की सभी पूल के लिए डेटा में दोहराया प्रत्येक दृश्य की आवृत्ति / कॉपी संख्या निर्धारित करने के लिए FASTA प्रारूप में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण डेटा के लिए कदम (पूरक कोड फ़ाइल देखें) छँटाई / कोड-लेखन का उपयोग करें:
    4. उच्चतम प्रतिलिपि संख्या की विशिष्टता के दृश्य और आत्मीयता का विश्लेषण करें। बातचीत (प्रोटीन या छोटे अणु), बंधन पर aptamer की संरचनात्मक गुणों, और उम्मीद की आत्मीयता के प्रकार उपयुक्त है जो विधि हुक्म चलाना होगा। इस विषय सन्दर्भ 1,28-30 की संख्या में आगे विस्तार से समीक्षा की जाती है।

    6. AuNP संश्लेषण और जांच

    1. साइट्रेट कमी विधि 21 का उपयोग कर AuNPs synthesize। उबलते के लिए 2 50 मिमी HAuCl 4 मिलीलीटर और गर्मी के साथ Millipore पानी की 98 मिलीलीटर मिलाएं।
    2. के रूप में 38.8 मिमी सोडियम साइट्रेट के 10 मिलीलीटर जोड़ेंभाटा शुरू होता है जल्द ही के रूप में। रंग कई मिनट के बाद एक लाल रंग के लिए बदल जाएगा। गर्मी बंद के साथ 20 मिनट के लिए समाधान सरगर्मी जारी रखें।
    3. AuNP समाधान के लिए एक 0.2 माइक्रोन पॉलिएस्टर झिल्ली के माध्यम से फिर आरटी को शांत फिल्टर करने के लिए अनुमति दें। एक अंधेरे एम्बर बोतल में सभी AuNP निलंबन स्टोर।
    4. 2.4 एक्स 10 8 एल मोल -1 सेमी -1 31 के विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग कर, यूवी अवशोषण द्वारा AuNP एकाग्रता की गणना। एकाग्रता गतिशील प्रकाश 21 बिखरने द्वारा निर्धारित 17 ± 0.6 एनएम के आकार के साथ, इस काम में 10 एनएम था।
    5. एल्यूमीनियम पन्नी द्वारा संरक्षित परिवेश की स्थिति में 1 घंटे के लिए 10 एनएम AuNP के साथ डीएनए सेते हैं। AuNP की मात्रा सभी वांछित परीक्षण प्रदर्शन करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त समाधान उपलब्ध कराने के लिए अलग अलग (~ 1-2 मिलीलीटर)। 73, 120, और 200 डी / एन पी (AuNP प्रति डीएनए अणु) के लोड हो रहा है घनत्व इस काम में जांच की गई है, और मात्रा और सांद्रता तदनुसार अलग अलग होंगे।
    6. एचईपी का उपयोग करते हुए 1: डीएनए पतला / AuNP समाधान 1ते बफर (20 ​​मिमी HEPES, 2 मिमी 2 MgCl, पीएच = 7.4)। मिश्रण एल्यूमीनियम पन्नी द्वारा कवर आरटी पर संतुलित करने की अनुमति दें।
      नोट: इस चरण के लिए आवश्यक समय शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। इस काम में कई मिनट से ओ को लेकर टाइम्स / एन जांच की गई।
    7. विश्लेष्य (कोर्टिसोल, cholic एसिड, 2-methoxynaphthalene) DMSO में 100 मिमी शेयर समाधान तैयार है और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया। कोर्टिसोल बाध्यकारी बफर (धारा 2.1) के एक 1/3 कमजोर पड़ने में 100 माइक्रोन के लिए शेयर के कमजोर पड़ने से प्रत्येक प्रयोग करने के लिए नए सिरे से प्रारंभिक समाधान से पहले बनाओ। इसके अलावा 1/3 बाध्यकारी बफर के साथ प्रारंभिक समाधान पतला ऐसी है कि लक्ष्य की एक निरंतर मात्रा (10 μl) सांद्रता की एक श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए जोड़ा गया है।
    8. 03/01 बाध्यकारी बफर के 10 μl के साथ डीएनए / AuNP समाधान के 80 μl जोड़कर आवश्यक नमक एकाग्रता का अनुकूलन ("रिक्त" के रूप में करने के लिए कहा गया है)।
      1. आरटी तो NaCl solut के विभिन्न संस्करणों को जोड़ने पर 20 मिनट के लिए सेतेआयन। नमक के अलावा (इस काम में इस्तेमाल किया 1 एम NaCl के 13-40 μl) के बाद एक नीले रंग की ओर एक मुश्किल से नेत्रहीन महत्त्वपूर्ण बदलाव लाती है कि नमक की मात्रा के लिए देखो। यह एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है, लेकिन लक्ष्य अलावा सहित परिणामों के बाद आगे समायोजन पड़ सकता है।
    9. लक्ष्य समाधान के 10 μl के साथ डीएनए / AuNP समाधान के 80 μl का मिश्रण है और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। हमेशा एक खाली (धारा 6.8) सहित एक साथ कई लक्ष्य सांद्रता का विश्लेषण करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली और multichannel विंदुक का उपयोग।
      1. NaCl समाधान की उचित मात्रा (1 एम NaCl के 13 μl इस काम में लागू किया गया था) जोड़ें और तुरंत एक प्लेट रीडर का उपयोग कर 650 और 530 एनएम पर absorbance का विश्लेषण।
    10. रिक्त माप के लिए लक्ष्य एकाग्रता सामान्यीकृत रिश्तेदार बनाम absorbance के मूल्यों के अनुपात (ई 650 / ई 530) के रूप में परिणाम साजिश।

Representative Results

शर्तों की तंगी शुरू में पहली बार कई दौर में कम प्रतिलिपि संख्या में मौजूद बाँधने बनाए रखने के लिए कम रखा गया था। पहले दौर, विशेष रूप से, आम तौर पर उच्च कोर्टिसोल और डीएनए सांद्रता, और नकारात्मक चयन चरणों की कमी के द्वारा प्रदर्शन अद्वितीय दृश्यों, के रूप में प्रस्तुत बाँधने की रक्षा करने के लिए सबसे कम तंगी लागू किया है। इस aptamer चयन की सफलता के दौर 12-13 (1 टेबल) में अपेक्षाकृत स्थिर बनी हुई है कि लक्ष्य से eluted एक उच्च अंश के लिए लक्ष्य (दौर 2) द्वारा eluted कम प्रतिशत से ताल के विकास के द्वारा प्रदर्शन किया है। लक्ष्य से eluted डीएनए के इस पठार पारंपरिक रूप से चयन ("संवर्धन") में एक समापन बिंदु है। हालांकि, इस पद्धति आगे सीडीएनए कब्जा जांच की लंबाई (चित्रा 1) में वृद्धि से संवर्धन के बाद चयन की तंगी उठाया। इस जांच को लंबी CDN के बीच संकरण की शक्ति बढ़ जाती हैए और पूल, परिसर के पिघलने के तापमान (टी एम) बढ़ रही है, और समाधान में बाध्यकारी दृश्यों जारी करने के लिए लक्ष्य और अनुक्रम के बीच एक मजबूत बातचीत की आवश्यकता होती है। चयन के प्रारंभिक दौर के कारण पुस्तकालय के 5'छोर पर एक कम जी आधार करने के लिए एक कमजोर सीडीएनए बातचीत लागू किया है। इस पहले दौर में आम तौर पर कम तंगी शर्तों के अनुरूप है, और काफी अगले चयन दौर के लिए पारित करने के लिए और अधिक संभावित बाँधने के रूप में अच्छी तरह से (dehybridize ऊष्मा के आधार पर) पृष्ठभूमि दृश्यों की अनुमति से अन्य की तुलना में चयन को प्रभावित करने की उम्मीद नहीं है। चयन के बाद के चयन के दौर में उच्च तंगी शर्तों को लागू करने से संवर्धन की ओर से जारी रखा के रूप में इन पृष्ठभूमि दृश्यों को कम से कम किया गया। सीडीएनए दौर 14 में एक 8 मेर करने के लिए एक सात-मेर से lengthened गया था, लक्ष्य से eluted डीएनए का प्रतिशत एक टी एम के लिए 11.1% से 15.3% से कम है 26.7 डिग्री सेल्सियस 19.2 डिग्री सेल्सियस से वृद्धि हुई है। सीडीएनए Wके रूप में आगे 3.3% करने के लिए eluted कुल छोड़ने, 31.3 डिग्री सेल्सियस के एक टी एम के साथ गोल 15 में 9 मेर लिए बढ़ा दिया।

संवर्धन पर आगे की जानकारी हर दौर में पूल की प्रगति को ट्रैक करने के क्रम में, कई पूल, दोनों समृद्ध और गैर-समृद्ध उदाहरण अनुक्रमण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) उच्च अनुक्रम सेंगर अनुक्रमण की तुलना में (दृश्यों की कुल संख्या रिपोर्ट) प्राप्त कर रहे हैं पढ़ता है, जिसका मुख्य कारण चयन में अनुक्रमण के लिए एक शक्तिशाली विधि के रूप में उभरा है। इन उच्च अनुक्रम, पूल में दृश्यों की कुल संख्या का एक बड़ा कवरेज पेश दृश्यों की विविधता की एक और पूरी तस्वीर प्रदान करने पढ़ता है। NGS भी क्लोनिंग पूर्वाग्रह 32 निकालता है, और बार कोड 24,33 के अलावा के साथ एक ही बैच में कई पूल के अनुक्रमण के लिए अनुमति देता है। NGS इस नमूने चयन में तीन अलग-अलग पूल (चित्रा 2) से संवर्धन की प्रगति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ताल6, गोल 13 (उच्चतम संवर्धन), और गोल 15 (उच्चतम तंगी) (मामूली संवर्धन eluted% से 2 दौर की तुलना में) के दौर से चयन के प्रतिनिधि अंक के रूप में चुने गए हैं। अनुक्रम की कुल संख्या का एक प्रतिशत प्रत्येक पूल के लिए पढ़ता के रूप में प्रत्येक अद्वितीय अनुक्रम की प्रतिलिपि संख्या साजिश रची थे। शीर्ष क्रम (उच्चतम प्रतिलिपि संख्या) अनुक्रम ही सर्वांगीण 6 में दृश्यों (33,435 कुल दृश्यों, 22,463 अद्वितीय दृश्यों) के 0.1% का गठन। पूल ज़्यादा से ज़्यादा गोल 13 में समृद्ध हो जाता है, शीर्ष स्थान पर रहीं अनुक्रम बढ़ जाती है यूवी द्वारा मनाया संवर्धन में केवल एक ~ 5x वृद्धि के बावजूद दौर 6 में से 150x उच्च पूरे पूल के 15.4% (17,681 कुल दृश्यों, 2987 अद्वितीय दृश्यों), शामिल करने के लिए । गोल 15 (28,919 कुल अनुक्रम 2980, पढ़ता अद्वितीय दृश्यों) यूवी संवर्धन निगरानी लक्ष्य से eluted राशि दौर में 13 की तुलना में ~ 5x कम दिखाया गया था कि भले ही शीर्ष स्थान पर अनुक्रम के प्रतिनिधित्व वाले सभी दृश्यों के 44.9% के लिए कूद गया ( तालिका एक

15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

पिछले अध्ययनों microscale thermophoresis और संतुलन डायलिसिस 24 से इन दो दृश्यों के बंधन की जांच की। परिणामों 6.9 ± 2.8 माइक्रोन संतुलन डायलिसिस द्वारा = अनुक्रम 15-1 (कश्मीर घ के लिए बाध्यकारी महत्वपूर्ण कोर्टिसोल दिखाया, 16.177; Microscale thermophoresis से 0.6 माइक्रोन) न्यूनतम बंधन जबकि कोर्टिसोल और अनुक्रम 15-3 के बीच मनाया गया। इस दौर में 15 में कब्जा जांच की वृद्धि की लंबाई उच्च आत्मीयता बांधने की मशीन बाहर पार्स करने के लिए उच्च तंगी शर्तों प्रदान करने में सहायता प्राप्त है कि पता चलता है। इसके अलावा, न तो अनुक्रम नकारात्मक चयन चरणों की है कि इसके अलावा, दिखा नकारात्मक चयन अणु, प्रोजेस्टेरोन के लिए बाध्य नमूदार प्रदर्शन किया प्रक्रिया के लिए फायदेमंद था।

एक उच्च आत्मीयता बांधने की मशीन ऊंचा तंगी की स्थिति के चयन के आगे राउंड में लागू किया गया के बाद (लक्ष्य से eluted डीएनए का प्रतिशत का विश्लेषण करने की पारंपरिक विधि द्वारा निर्धारित) अधिक से अधिक संवर्धन निम्नलिखित उभरा तथ्य यह है कि सीडीएनए कब्जा की लंबाई को विस्तार देने के विधि पुष्टि पोस्ट-संवर्धन की जांच। लक्ष्य के लिए एक अनुक्रम पूल और आत्मीयता से नंबर की प्रतिलिपि है कि इस परिणाम से पता चलता है कि केवल चुनाव में, कुछ शर्तों के 24,34 के तहत जुड़ा हो सकता हैएक सीधा संबंध 35 जिसका अर्थ है एक पूर्व रिपोर्ट के साथ trast। यह भी नहीं बल्कि केवल उच्च तंगी शर्तों लागू कर रहे हैं के रूप में करने के लिए अगले एक दौर से स्वाभाविक रूप से भिन्न हो सकते हैं, जो सबसे अधिक चयन में आम% eluted रणनीति, द्वारा की तुलना में, NGS द्वारा निगरानी संवर्धन के लाभ पर प्रकाश डाला गया। इसी तरह की स्थिति कई दौर भर में लागू कर रहे हैं फिर भी, जब eluted% निगरानी संवर्धन के लिए उपयोगी है। उदाहरण के लिए, संवर्धन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन (तालिका 1) के साथ, 6-10 शामिल सभी इसी तरह की स्थिति दौर। यह कई राउंड में मनाया जाता है, स्थितियों की संभावना संवर्धन को बढ़ावा देने के लिए भी कड़े हैं, और शोधकर्ता अगले दौर में तंगी कमी करनी चाहिए। , समायोजन के लिए एक गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैं eluted% उदाहरण के लिए, कोर्टिसोल एकाग्रता राउंड 11-13 में 100 माइक्रोन से 35 माइक्रोन से बढ़ा दिया गया था, और% इसलिए दौर 12. में 14.5% करने के दौर में 10 में 2.5% से बढ़कर eluted एक चयन के दौरान तंगी simil जबगिरफ्तारी शर्तों दौर के दौर से तुलना कर रहे हैं, और एक चयन समापन बिंदु के निर्धारण के लिए NGS के पूरक जानकारी उपलब्ध करा सकता है।

अनुक्रम 15-1 एक तरीके से चयनित एक दृश्य एक संरचना-स्विचिंग aptamer एक प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए बाध्यकारी लक्ष्य के बाद एक संरचनात्मक परिवर्तन पर निर्भर करता है कि एक परख में कार्य करेगा निर्माण करने के लिए निर्धारित करने के लिए एक AuNP परख करने के लिए लागू किया गया था। पिछला प्रारंभिक पढ़ाई 15-1 साथ AuNP परख तनाव बायोमार्कर कोर्टिसोल को जवाब दिया है, लेकिन तनाव, एपिनेफ्रीन और norepinephrine, या cholic एसिड की नहीं करने के लिए दो अन्य मार्करों, structurally समान जिगर की बीमारी का एक मार्कर 24 कोर्टिसोल को दिखाया। प्रतिक्रिया कोर्टिसोल बाध्यकारी पर एक संरचनात्मक बदलाव के लिए चयनित aptamer AuNP परख में एक प्रतिक्रिया है कि उत्पादन को मान्य मानव सीरम (~ 150-600 एनएम) 6, में सूचना दी मुक्त कोर्टिसोल के सामान्य श्रेणी में मनाया गया। इस वर्तमान काम में, प्रणाली के लक्षण वर्णन का समायोजन करके एक कदम आगे ले जाया गयाAuNP सतह पर 15-1 की कवरेज (घनत्व)। शर्तों के एक ही सेट का उपयोग करना, डीएनए कवरेज 120 डी / एन पी और 200 डी / एन पी (चित्रा 3) के लिए, 73 डी / एन पी (डीएनए अणु / AuNP) से वृद्धि हुई थी। Cholic एसिड 200 डी / एन पी में 10 माइक्रोन के अपवाद के साथ एक न्यूनतम प्रतिक्रिया, का उत्पादन किया। पता लगाने की सीमा (लोद) के रूप में किया कवरेज के रूप में कम परख की प्रतिक्रिया बढ़ा दिया गया था। लोद 73 डी / एन पी, 120 डी / एन पी के लिए 145.2 एनएम, और 200 डी / एन पी के लिए 27.3 माइक्रोन के लिए 29.5 एनएम था। इस परिणाम aptamer कवरेज 300 डी / एन पी 36 के लिए 60 डी / एन पी से बढ़ा दिया गया था जब कोकीन aptamer उपयोग एक AuNP परख की प्रतिक्रिया में कमी आई कि सचित्र जो स्मिथ एट अल। के काम के साथ सहमत हैं। यह ब्याज के लक्ष्य के लिए पता लगाने रेंज समायोजित AuNP परख में डीएनए सतह कवरेज के अनुकूलन के आधार पर किया जा सकता है कि निकलता है। उदाहरण के लिए, की तुलना करते हैं तो यह फायदेमंद हो सकता है, मानव सीरम मानव लार बनाम (~ 150-600 एनएम) (~ 5-25 एनएम) में नि: शुल्क कोर्टिसोल की रेंज <समर्थन> 6,37। शारीरिक तरल पदार्थ इस बफर परख की तुलना में कहीं अधिक जटिल हैं, परिणाम आवेदन के आधार पर AuNP शर्तों समायोजित किया जा सकता है कि प्रदर्शन के सबूत की सिद्धांत काम पर एक विस्तार है, और जैविक तरल पदार्थ के लिए माध्यम का विस्तार करने के लिए किया जाएगा की ओर है कि आगे काम प्रदान biosensor समुदाय के लिए ब्याज की।

चित्र 1
चित्रा संरचना-स्विचिंग चयन विधि 1. अवलोकन। एक छोटा सा biotinylated सीडीएनए कब्जा जांच streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों पर स्थिर है। सीडीएनए मोतियों के लिए पुस्तकालय hybridizing, पुस्तकालय की 5'क्षेत्र के लिए पूरक है। लक्ष्य जोड़ा जाता है, एक गठनात्मक परिवर्तन एक चुंबक लगाने से मदद की विभाजन की अनुमति देता है, मनका से बाध्यकारी दृश्यों जारी करने के लिए प्रेरित किया जाता है। सतह पर तैरनेवाला (% डीएनए वें द्वारा eluted संवर्धन नजर रखने के लिए बनाए रखा हैडीएनए से लक्ष्य dialyzing के बाद यूवी द्वारा ई लक्ष्य)। लक्ष्य अणु डीएनए के रूप में ही यूवी रेंज में अवशोषित कर लेता है, तो यह कदम केवल आवश्यक है। दृश्यों तो पीसीआर प्रवर्धित और चयन के निम्नलिखित दौर के लिए तैयार कर रहे हैं। चयन की प्रगति, नकारात्मक चयन नकारात्मक चयन अणु द्वारा eluted दृश्यों खारिज कर रहे हैं, जहां, लागू किया जाता है, और संभावित लक्ष्य बाँधने के साथ मोती तो लक्ष्य के साथ incubated रहे हैं। सीडीएनए जांच की लंबाई चयन की तंगी को बढ़ाने के लिए अधिक से अधिक संवर्धन (eluted%) निम्न वृद्धि हुई है। यह आंकड़ा 24 से अनुमति के साथ reprinted किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> 2.1
दौर [कोर्टिसोल] (माइक्रोन) [प्रोजेस्टेरोन] (माइक्रोन) बाध्य डीएनए (pmol) % लक्ष्य से eluted सीडीएनए की लंबाई
1 100 0 357.57 एन / ए 7-मेर
2 50 0 145.49 1.4 7-मेर
3 50 1 188.74 एन / ए 7-मेर
4 50 5 336.4 2.3 7-मेर
5 35 5 88.05 एन / ए 7-मेर
6 35 10 303.89 3.1 7-मेर
7 35 10 255.01 एन / ए 7-मेर
8 35 10 236.81 7-मेर
9 35 10 318.95 2.6 7-मेर
10 35 10 297.18 2.5 7-मेर
11 100 10 147.61 एन / ए 7-मेर
12 100 10 154.36 14.5 7-मेर
13 100 10 150.39 15.3 7-मेर
14 75 20 247.71 11.1 8-मेर
15 50 40 409.63 3.3 9-मेर

% क्षालन 24 <द्वारा तालिका 1. चुनाव में प्रगति और संवर्धन (लागू नहीं) मजबूत>। एन / ए डायलिसिस / यूवी संवर्धन निगरानी कम प्रतिलिपि संख्या दृश्यों के नुकसान को कम करने के लिए जल्दी चयन राउंड में प्रदर्शन नहीं कर रहा था, जहां राउंड के लिए सूचना दी है। इस तालिका में 24 से अनुमति के साथ reprinted किया गया है।

चित्र 2
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा निर्धारित चित्रा 2. चुनाव संवर्धन (ए) के दौर 6। (बी) के दौर 13; (सी) दौर 15. दृश्यों संख्या की प्रतिलिपि के अनुसार क्रमबद्ध किया गया। उच्चतम प्रतिलिपि संख्या अनुक्रम पूल कोर्टिसोल बाध्यकारी दृश्यों के लिए समृद्ध था के रूप में गोल 15 (44.9%) में एक उच्च प्रतिशत के दौर 6 (0.1%) में पूरे अनुक्रम पूल के कम प्रतिशत का गठन करने से वृद्धि हुई है। यह आंकड़ा 24 से अनुमति के साथ reprinted किया गया है।एट = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Aptamer 15-1 कवरेज अलग से चित्रा 3. AuNP परख प्रतिक्रिया। AuNPs साथ incubated aptamer का घनत्व 120 डी / एन पी (हरी वर्ग) और 200 डी / एन पी (करने के लिए, 73 डी / एन पी (लाल त्रिकोण) से वृद्धि हुई थी नीले वृत्त)। कोर्टिसोल प्रतिक्रियाओं बोल्ड रंग हैं, cholic एसिड प्रतिक्रिया हल्के रंग में है। परख प्रतिक्रिया इस प्रकार लोद और लक्ष्य के भीतर पता लगाया जा सकता सीमा को कम करने, कम घनत्व में कोर्टिसोल के लिए सुधार हुआ है। उच्चतम कोर्टिसोल प्रतिक्रिया (73 डी / एन पी) के साथ शर्तों एनएम 5-25 (मानव सीरम (~ 150-500 एनएम) और लार में रिपोर्ट मुक्त कोर्टिसोल की उम्मीद की सामान्य सीमा के भीतर और अधिक अंक प्रदान करने के लिए रेखीय श्रृंखला में आगे विशेषता थे ) 6,37। वही 73 डी / एन पी शर्तों को लागू करने cholic एसिड की न्यूनतम प्रतिक्रिया हो गया हैएन पिछले काम 24 में विस्तृत जानकारी दी। सभी भूखंडों डुप्लिकेट या तीन प्रतियों माप के लिए SEM के मतलब ± प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 4
। पीसीआर चक्र अनुकूलन से चित्रा 4. प्रतिनिधि परिणामों से कुओं दाएं से बाएं प्रतिनिधित्व करते हैं: 4 चक्र, छह चक्र, आठ चक्र, 10 चक्र, 12 चक्र, नकारात्मक (कोई डीएनए टेम्पलेट), 25 बीपी डीएनए सीढ़ी मानक। इष्टतम स्थितियों एकल उत्पाद बैंड उच्चतर चक्रों में उपस्थित पर- प्रवर्धन उत्पादों के बिना उच्च तीव्रता पर है, जहां आठ चक्र, पर मनाया जाता है।

चित्रा 5
चित्रा 5. AuNP परख ऊष्मायन समय अनुकूलन। 73 डी में AuNP / डीएनए कदम की ऊष्मायन समय / एन पी ओ से कम हो गया था / एन (चित्रा 3) को 30 मिनट, और लक्ष्य incubation तुरंत नमक अलावा द्वारा बजाय 20 मिनट (चित्रा 3) के बाद किया गया। (ए) एक प्रतिक्रिया कोर्टिसोल (नीले हीरे) के लिए मनाया जाता है लेकिन नहीं cholic एसिड (हरी हलकों) या 2MNP (2-methoxynaphthalene; लाल वर्गों) के लिए। सभी भूखंडों डुप्लिकेट या तीन प्रतियों माप के लिए SEM के मतलब ± प्रतिनिधित्व करते हैं। बाएं से दाएं (बी): रिक्त, 10 माइक्रोन कोर्टिसोल, 10 माइक्रोन cholic एसिड, 10 माइक्रोन 2MNP। दृश्य परिवर्तन कोर्टिसोल के लिए नग्न आंखों से देखा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

छोटे अणुओं जैविक ब्याज की हैं, लेकिन केवल सूचना दी सब aptamers के 19% का गठन तथ्य यह है कि महान महत्व के छोटे अणुओं को लागू कर रहे हैं कि aptamers के चयन के लिए डिजाइन तरीकों प्रदान करता है। छोटे अणुओं की SELEX प्रोटीन एक की तुलना में दृश्यों के साथ बातचीत के लिए उपलब्ध हैं कम कार्य समूहों, संरचनात्मक रूपांकनों, और सतह क्षेत्र के रूप में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है, और यह प्रयास किया सभी लक्ष्यों के लिए चयन की 30% से कम एक aptamer में हुई है कि अनुमान लगाया गया है 38। इसलिए, एक सफलतापूर्वक एक छोटा सा अणु लक्षित करने के लिए एक aptamer चयन करने के क्रम में प्रयोगात्मक डिजाइन और निष्पादन की असाधारण बारे में पता होना चाहिए।

यह उनके बाध्यकारी गुण बदल सकता है जो किसी भी रासायनिक संशोधन की आवश्यकता के बिना छोटे अणुओं के लिए लागू है, क्योंकि इस काम में वर्णित aptamer चयन विधि फायदेमंद है। यह भी टी के बाद से जिसका मतलब है कि आधारित क्षालन है,ब्याज की अणु को बाँधने सतह पर तैरनेवाला बफर में जारी कर रहे हैं क्योंकि वह डीएनए, बल्कि लक्ष्य की तुलना में, शुरू में मनका मैट्रिक्स के साथ बातचीत के डीएनए चयन के अगले दौर के लिए परिलक्षित नहीं किया जाएगा, तो लक्ष्य से चुंबकीय मोतियों से eluted ही है और अविशिष्ट मैट्रिक्स बाँधने बाध्य रहते हैं। इसके विपरीत, मैट्रिक्स के खिलाफ एक नकारात्मक चयन विधि मैट्रिक्स के साथ सूचना का आदान कि डीएनए लक्ष्य बाँधने एक के अलावा परिलक्षित हो जाएगा क्योंकि ठोस समर्थन करने के लिए प्रत्येक दौर लक्ष्य स्थिर है कि तरीकों के लिए आवश्यक है। वर्तमान पद्धति एक टी एम सीमित चयन रणनीति के रूप में डिजाइन किया गया था। इस सीडीएनए / पूल संकरण की टी एम आर टी के करीब रखा गया था कि इसका मतलब है। मोर्स एक समान रणनीति का प्रयोग किया है, लेकिन 4 डिग्री सेल्सियस 17 में चयन शर्तों के साथ एक टी एम <10 डिग्री सेल्सियस के साथ एक 6-मेर सीडीएनए जांच लागू होता है। हमारे आवेदन आरटी पर प्रदर्शन किया biosensing परख के लिए था, इसलिए सीडीएनए की लंबाई के अनुसार समायोजित किया गयाly है। लक्ष्य बाध्यकारी बातचीत बाध्यकारी सीडीएनए में खलल न डालें के लिए सक्षम एक गठनात्मक परिवर्तन के लिए प्रेरित नहीं करता है एक दूरस्थ स्थान में होता है क्योंकि संभावित बाँधने नहीं खो रहे हैं इतना है कि यह काफी कम चयन की तंगी रहती है। कुछ दृश्यों केवल ऊष्मा के आधार पर dehybridize होगा क्योंकि हालांकि, प्रस्तावित विधि के विभाजन की क्षमता कम है। 15-पूर्व के टी एम एक छोटा सा अणु लक्ष्य से एक रिलीज की अनुमति के लिए बहुत अधिक थी क्योंकि इसके विपरीत, Nutiu एट अल। एक 15-मेर सीडीएनए लागू है, और केवल संभवतः, चार लक्ष्यों में से दो के लिए aptamers की पहचान करने में सक्षम थे 18। इसलिए, वर्तमान चयन रणनीति चयन की तंगी को नियंत्रित करने और सफलता की संभावना बढ़ जाएगा संभावित बाँधने के नुकसान को कम करके, पृष्ठभूमि दृश्यों को हटाने के लिए कई दौर की आवश्यकता होगी, जबकि।

Aptamer चयन करने के लिए नए कई शोधकर्ताओं की पीसीआर से संबंधित महत्वपूर्ण पहलुओं में से अनजान हैंसंभावित बाँधने। डीएनए पुस्तकालयों की ओवर-प्रवर्धन द्वारा उत्पादों उच्च चक्र संख्या में (आकार में आम तौर पर बड़ा) अवांछित पैदा करता है, और वांछित उत्पाद पूरी तरह से केवल 5 चक्रों 39 की एक अतिरिक्त के साथ गायब हो सकता है क्योंकि साइकिल अनुकूलन (खंड 4.5) के लिए आवश्यक है। ओवर-प्रवर्धन के मामले में, पीसीआर उत्पादों नहीं रह लक्ष्य से eluted उन दृश्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और चयन सफलता की संभावना काफी कम हो जाता है। 4 इस काम में 5 दौर से चक्र अनुकूलन का एक उदाहरण दिखाता है चित्रा। सबसे कम चक्र एक न्यूनतम उत्पाद बैंड, 8 चक्र के माध्यम से राशि में बैंड बढ़ जाती है पैदा करता है; 10 चक्र में बैंड एक उच्च आकार से अधिक प्रवर्धन उत्पाद के लिए एक संक्रमण शुरू होता है, और लगभग पूरी तरह से 12 चक्रों के भीतर खत्म हो प्रवर्धित उत्पाद के शामिल है। कई शोधकर्ताओं को नजरअंदाज कर सकते SELEX में अनुभवहीन है कि एक और विस्तार पूरे पूल बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रवर्धन में परिलक्षित होना चाहिए कि एफआईआर में (धारा 4.6) हैसेंट दौर बाँधने के नुकसान को कम करने के लिए। oligonucleotides से संभव अद्वितीय दृश्यों की संख्या चार चार न्यूक्लिक एसिड अड्डों का प्रतिनिधित्व करता है, जहां चार एन, है, और एन पुस्तकालय के यादृच्छिक क्षेत्र में अपने अड्डों की संख्या है। 1.2 एक्स 10 24 संभव अद्वितीय दृश्यों के दृश्यों अंतरिक्ष में जिसके परिणामस्वरूप इस काम, एन = 40, के लिए। चयन के पहले दौर में इस्तेमाल किया पुस्तकालय का 2.5 nmol मेल खाती करने के लिए ~ 10 से 15 अणु, डीएनए के प्रत्येक प्रतिलिपि संभावना एक अनूठा दृश्य के रूप में प्रारंभिक पूल में प्रतिनिधित्व किया है जिसका अर्थ है कि। इसलिए, लक्ष्य से मोतियों से eluted डीएनए की पूरी मात्रा चयन के अगले दौर के लिए प्रत्येक संभावित बांधने की मशीन की एक प्रतिलिपि बनाए रखने के लिए परिलक्षित होना चाहिए। इस प्रारंभिक प्रवर्धन हुई है एक बार, कई प्रतियां एक समरूप समाधान नमूना लेने के लिए माना जाता है, जहां निम्न राउंड में चयन के लिए उपलब्ध हैं।

लक्ष्य की एकाग्रता भी ध्यान से हर दौर में विचार किया जाना चाहिए। Nutiu एट अल। उपयोगदा चयन प्रक्रिया के दौरान 1 मिमी लक्ष्य की एकाग्रता, और कश्मीर डी = 600 माइक्रोन 18 के साथ एक एटीपी aptamer का चयन किया। मौजूदा काम और मोर्स 17 के अनुसंधान दोनों के चयन के पाठ्यक्रम में कम है, 100 माइक्रोन लक्ष्य के साथ शुरू हुआ, और कम micromolar समानताएं साथ aptamers में हुई। वास्तव में तंगी के दौर (कम लक्ष्य एकाग्रता) संवर्धन मनाया जाता है जब इस पर निर्भर करता वृद्धि की जानी चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम aptamers लक्ष्य अणु को विशिष्टता का प्रदर्शन तो उचित नकारात्मक चयन चरणों को लागू करने के लिए है। नियंत्रण का उपयोग किया जाता है जिसमें चयनित aptamer का इरादा आवेदन पर प्रासंगिक है। उदाहरण के लिए, aptamer 15-1 कोर्टिसोल के लिए एक biosensing परख में एक मान्यता तत्व के रूप में कार्य करने के लिए डिजाइन किया गया था, तो यह शारीरिक तरल पदार्थ 40 में पाया जाता है कि कोर्टिसोल के लिए एक चयापचय अग्रदूत है क्योंकि प्रोजेस्टेरोन एक नकारात्मक चयन अणु के रूप में इस्तेमाल किया गया था। Nutiu एट अल द्वारा चयनित एटीपी aptamer। </ Em> एक नकारात्मक चयन कदम शामिल हैं, और ADP, एएमपी, एडेनोसाइन, और dATP 18 सहित structurally समान अणुओं के साथ सूचना का आदान प्रदान नहीं किया।

विचार के लिए एक अंतिम ध्यान दें AuNP परख अक्सर प्रत्येक aptamer / लक्ष्य जोड़ी के लिए काफी अनुकूलन की आवश्यकता है। नमक के बाद इसके अलावा एक नीले रंग की ओर एक मुश्किल से नेत्रहीन महत्त्वपूर्ण बदलाव लाती है कि नमक की मात्रा के लिए खोज एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन प्रारंभिक बिंदु के समायोजन के लिए एक प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है। हम यह भी परख (बफर एकाग्रता (buffers की उच्च नमक एकाग्रता अक्सर एकत्रीकरण का कारण बनता है क्योंकि चयन बफर कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है) और रचना, डीएनए कवरेज की डिग्री (चित्रा 3), नमूना तैयार करने पर कुछ जैविक आधार काफी अलग प्रतिक्रिया पैदा करता है कि मिल गया है लक्ष्य को भंग करने के लिए इस्तेमाल सॉल्वैंट्स एक उच्च मास्क प्रतिक्रिया है कि लक्ष्य पृष्ठभूमि), तापमान, नमक के प्रकार और एकाग्रता, और incuba कारण हो सकता है(AuNP और लक्ष्य के साथ डीएनए / AuNP के साथ दोनों डीएनए के) tion के समय। पूरी तरह से अनुकूलित शर्तों के तहत, परिणाम आम तौर पर AuNP biosensing मंच की एक तेजी से लक्ष्य प्रतिक्रिया के लाभ का प्रदर्शन, एक लक्ष्य ऊष्मायन समय <5 मिनट के साथ मनाया जाता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 aptamer की ऊष्मायन समय में / AuNP कदम 30 मिनट के लिए ओ से / एन (चित्रा 3) कम हो गया था, और नमक तुरंत (<10 सेकंड) लक्ष्य के बाद इसके अलावा बजाय 20 मिनट के बाद (चित्रा 3 जोड़ा गया है ) 73 डी / एन पी के एक लोडिंग घनत्व पर। यह पिछले शर्तों (चित्रा 3) का उपयोग कर 40% ~ बनाम 10 माइक्रोन लक्ष्य एकाग्रता में कोर्टिसोल प्रतिक्रिया के लिए ~ रिक्त (चित्रा 5 ए) की तुलना में 82% अधिक वृद्धि हुई है। यह प्रतिक्रिया नग्न आंखों (चित्रा 5 ब) के साथ प्रतिष्ठित किया जा सकता है। कोर्टिसोल का पता लगाने के रैखिक सीमा, पिछले शर्तों का उपयोग कर इन शर्तों के एक वांछित के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, सुझाव है कि तुलना में अलग है कि नोटअनुसंधान का विस्तार। Cholic एसिड और 2-methoxynaphthalene (2MNP) नियंत्रण एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया (आंकड़े 5A-बी) का उत्पादन नहीं किया। शोधकर्ताओं ने इन ऊष्मायन समय को कम करने के लिए समग्र बढ़ाया संकेत (लक्ष्य) या पृष्ठभूमि (गैर लक्ष्य अणुओं) के लिए योगदान कर सकते हैं जो AuNP सतह के साथ analytes की वृद्धि की प्रतिक्रिया की सुविधा हो सकती है कि बारे में पता होना चाहिए। इसलिए, सावधान AuNP परख डिजाइन और प्रदर्शन के लक्षण वर्णन प्रत्येक aptamer / लक्ष्य जोड़ी के लिए आवश्यक है।

इस प्रक्रिया के लक्ष्य की उपस्थिति का पता लगाने के लिए डीएनए के एक गठनात्मक परिवर्तन की आवश्यकता होती है, जो इस तरह वर्णित AuNP परख के रूप में एक biosensing मंच में समारोह में कहा कि छोटे अणु संरचना-स्विचिंग aptamers को चुनने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हालांकि, इस पद्धति के लगभग किसी भी आकार के लक्ष्य के लिए एक ही आधार पर समारोह में कहा कि इस तरह के विद्युत रासायनिक या प्रतिदीप्ति के रूप में अन्य biosensor सिस्टम को लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की शक्ति आगे से प्रयोगात्मक विकसित किया जा सकताकई दृष्टिकोण। सबसे पहले, चयन में ही संभवतः इस तरह की राशि को कम करने के लिए काफी मजबूत है, अभी तक एक छोटा सा अणु लक्ष्य के साथ बातचीत करने के लिए पर्याप्त रूप से कमजोर है कि एक बातचीत प्रदान करता है कि सीडीएनए / पुस्तकालय संकरण की आदर्श टी एम के निर्धारण के रूप में अनुकूलन के तरीकों की जांच से सुधार किया जा सकता है पृष्ठभूमि के दृश्यों ऊष्मा से केवल dehybridized। यह श्रम में समय की बचत और अभिकर्मक की खपत को कम करने, चयन के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या गाढ़ा होगा। चयन करने के लिए संशोधन में आगे की जांच के दृश्यों की एक विविध जनसंख्या विशेष रूप से प्रारंभिक दौर में लक्ष्य से अवगत कराया है कि इतनी माला और डीएनए की सबसे अनुकूल सांद्रता निर्धारित करने के लिए किया जाएगा। इन प्रमाण-की-सिद्धांत प्रयोगों की सफलता के अनुकूलन और शारीरिक तरल पदार्थ को AuNP बफर परख आदत डाल करने की दिशा में आगे संसाधनों का निवेश करने के लिए एक आधार प्रदान करते हैं। एक तेजी से, मजबूत biosensing प्लेटफॉर्म के लिए एक वैध की जरूरत है कि फू सकता हैnction मानव सीरम में AuNP परख के एक एक व्यक्ति की शारीरिक स्थिति के नैदानिक ​​उपकरण, और आगे के विकास के रूप में, पसीना, या लार एक इस मौजूदा खाई को पूरा करेगा।

Disclosures

वितरण बयान: सार्वजनिक रिहाई के लिए स्वीकृत किया गया है; वितरण (88 ABW-2014-4103) असीमित है। लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads M280 Streptavidin Invitrogen 112.06D Compatible with DynaMag-2 Magnet
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin
Streptavidin Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5113-01 This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation
Hydrocortisone Sigma H4001 ≥98%
Progesterone Sigma P0130 ≥99%
Cholic Acid Sigma C1129 ≥98%
NanoDrop ND-1000 NanoDrop ND-1000 Replaced by ND-2000 model
Tris Base Promega H5135 ≥99.9%
Sodium Chloride Sigma S9888 ≥99.5%
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98%
500 ml Filter System Corning 430769 0.22 µm cellulose acetate membrane
DNA Library Operon Custom HPLC purified
All other DNA IDT Custom Capture probes and primers — desalted; Aptamers — HPLC
Thermomixer  Eppendorf R Any model with  temperature and mixing speed control will work
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn Agilent 600674 Taq polymerase can be used as well
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade  Agilent 200415 Other brands will work here
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer Agilent 200532 This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase
GeneAmp PCR System Applied Biosystems 9700 Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work
Agarose-LE Ambion AM9040 ≥99.9%
Ethidium Bromide Sigma E-1510 Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style Glen Research 20-0021-01 This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe
Replacement Filters Expedite Glen Research 20-0021-0F 1 µm size
Illustra NAP-25 Columns GE Healthcare 17-0852-01 Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette ThermoFisher Scientific 66205 2k MWCO used
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important
Sodium Citrate Dihydrate SAFC W302600 We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays
SpectraMax  Molecular Devices M5 Results were similar to Bio-TEK system
Synergy Bio-TEK HT Results were similar to Molecular Devices system
HEPES Buffer Amresco J848 Any brand that makes a sterilized product will work
250 ml Filter System Corning 430767 0.22 µm cellulose acetate membrane
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Other brands will work here
5 ml Syringe Becton-Dickinson 309646 This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column
ThermoEC Minicell Primo ThermoFisher Scientific EC320 Compatible with Power Supply
Power Supply Fisher Scientific FB300 Compatible with ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl Sulfoxide Sigma D8418 Flammable liquid
2-Methoxynaphthalene Sigma 148245 99%
Assay Plate Corning 3370 96-well Flat Bottom, Sterile

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 96 aptamer संरचना-स्विचिंग SELEX छोटे अणु कोर्टिसोल अगली पीढ़ी के अनुक्रमण सोने nanoparticle है परख
एक वर्णमिति गोल्ड nanoparticle के परख लागू करने के लिए संरचना-स्विचिंग aptamers चुनने के लिए एक विधि
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