Abstract
Små molekyler gi rike mål for biosensing programmer på grunn av deres fysiologiske implikasjoner som biomarkører for ulike aspekter av menneskers helse og ytelse. Nukleinsyre aptamerer har blitt stadig mer brukt som gjenkjennelseselementer på biosensor plattformer, men velge aptamerer mot små molekyl mål krever spesielle design hensyn. Dette arbeidet beskriver modifikasjon og kritiske trinn i en metode utviklet for å velge struktur bytte aptamerer til små molekyl mål. Bindings sekvenser fra en DNA-bibliotek hybridisert til komplementær DNA oppfangingsprober på magnetiske kuler er adskilt fra nonbinders via en target-indusert endring i konformasjon. Denne fremgangsmåte er fordelaktig fordi sekvenser bindende bærermassen (perler) ikke vil bli ytterligere forsterket, og den ikke krever immobilisering av målmolekylet. Imidlertid er smeltetemperaturen for fangst probe og biblioteket ble holdt ved eller litt over romtemperatur, slik at sekvensene tlue dehybridize basert på termodynamikk, vil også være til stede i den overliggende oppløsning. Dette begrenser effektivt partisjone effektivitet (evne til eget mål bindende sekvenser fra nonbinders), og derfor mange valgrunder vil bli pålagt å fjerne bakgrunns sekvenser. Den rapporterte metoden skiller seg fra tidligere struktur bytte aptamer valg på grunn av implementering av negative seleksjons trinn, forenklet berikelse overvåking, og utvidelse av lengden på fangst sonde følgende utvalg berikelse å gi økt stringens. De valgte struktur veksling aptamerer er fordelaktig i en gull nanopartikkel assay plattform som rapporterer tilstedeværelse av et målmolekyl ved konformasjonsendring av aptamer. Gullet nanopartikkel assay ble anvendt fordi den er en enkel, rask kolorimetrisk avlesning som er fordelaktig i en klinisk eller distribuert miljø. Design og optimalisering hensyn presenteres for analysen som proof-of-principle arbeid i buffer for å gi et grunnlag for videre forlengelse av arbeidet mot lite molekyl biosensing i fysiologiske væsker.
Introduction
Små molekyler har lenge vært anerkjent som å spille viktige roller i ulike biologiske prosesser som fysiologisk toksisitet eller ernæring, cellesignalering, og som farmasøytiske behandlinger til sykdom 1. En rekke små molekyler er også blitt foreslått som biomarkører indikative av fysiologiske tilstander som stress 2,3, tretthet 4 og 5 sykdom. For eksempel, forhøyede kortisolnivåer korrelerer med stress som kan føre til redusert fysiologisk ytelse og andre helsemessige forhold 6-8. Likeledes, variasjoner i prosenter av visse peptider i spytt er prediktiv av trøtthet, der fysiologiske manifestasjoner inkluderer mangel på konsentrasjon, nedsatt reaksjonstid og redusert kognitiv funksjon 4. Derfor kan utviklingen av målspesifikke biosensorer for å overvåke nivåene av små molekyler gir en uvurderlig målet for å vurdere de helsemessige og yteevnen til en individual.
Historisk har lite molekyl deteksjon blitt utført av arbeidsintensive separasjonsteknikker eller ved antistoff basert anerkjennelse 6,7. Mer nylig har nukleinsyre aptamerer 9,10 dukket opp som gjenkjenningselementer som besitter distinkte fordeler i forhold til antistoffer i spesielle anvendelser. Med sin evne til å binde et mål varierende i størrelse fra metallioner 11 til vev 12, har aptamerer blitt mye brukt som gjenkjennelseselementer i biosensing plattformer 13,14. Sammenlignet med antistoffer, er aptamerer kjemisk syntetisert, og det er derfor enkelt å innføre reproduserbare kjemiske modifikasjoner for overflate immobilisering eller rapportering. Aptamerer kan velges med høy target spesifisitet under de ønskede forholdene ved å endre valg betingelser som benyttes, mens antistoffer er begrenset til fysiologiske forhold 15,16. I tillegg, aptamerer er i stand til større tetthet på grunn av ligand til thEir mindre størrelse, noe som resulterer i høyere target signaleringseffektivitet på en biosensor-plattform, og den forbedrede stabilitet av aptamerer tillater gjentatt bruk og langtidslagring 16. sensor.
Aptamerer er generert ved hjelp av en fremgangsmåte kjent som SELEX, karakterisert ved at en første bibliotek av sekvenser som er utviklet seg fra 10 13 -10 15 unike molekyler til en anriket slutt basseng som inneholder flere (10 1 -10 2) sekvenser med potensialet for å binde målmolekylet. Den endelige anriket bassenget blir deretter sekvensert, og dissosiasjonskonstantene (K d) oppnås fra bindingsanalyser av de høyeste kopitallsekvenser med målmolekylet. Evolusjon av bassenget til en endelig beriket befolkning spores ved å overvåke andelen bassenget bindende målet i hver runde, inntil maksimal berikelse oppnås. Dette skjer over en rekke evolusjonære runder, hvor bindende sekvenser er partisjonert fra nonbinders og amplsert ved hjelp av polymerase kjedereaksjon (PCR). Evnen til å effektivt partisjonere og beholde bindemidler er en av de viktigste faktorer som bestemmer effektiviteten av valg og direkte påvirker egenskapene til de valgte aptamerer 15. Den SELEX partisjone scenen er mer utfordrende for små molekyler, siden de ikke har den størrelsen eller rekke funksjonelle grupper som hjelper partisjoneringsprosessen protein mål 1,15. For eksempel er mange proteiner partisjone plattformer avhengige størrelse eller ladning basert separasjon, men egenskapene av bundet DNA-småmolekylære target-komplekser er generelt ikke signifikant forskjellig enn for ikke-bindende sekvenser, noe som resulterer i ineffektiv partisjone 1. Alternative SELEX partisjone metoder kan involvere immobilisering eller etikettering av målet, som potensielt kan endre de bindende egenskapene til et lite molekyl. Følgelig til utforming av en utvelgelsesprosedyre generere aptamerer for lite molekyl rettet requires spesielle hensyn.
En rekke modifikasjoner er blitt påført på den opprinnelige SELEX metode for å forbedre effektiviteten oppdeling av prosedyren, forbedre affiniteten og spesifisiteten av sekvensene i den endelige basseng, eller gjøre den mer mottagelig for forskjellige applikasjoner 15,16. En SELEX modifikasjon i stand til å velge for små molekyler er designet for å generere struktur-bytte aptamerer eller aptamerer som gjennomgår en konformasjonsendring på samspill med målmolekyl 17,18. I ett eksempel på denne fremgangsmåten, blir biblioteket hybridisert til et kort stykke av ikke-bindende komplementært DNA (cDNA) immobilisert på magnetiske kuler 17. Ved target binding, muliggjør konformasjonsendring bindingssekvenser dem til dehybridize fra cDNA og frigjør dem inn i det overliggende oppløsning, mens de resterende nonbinders hybridiserte til cDNA / perlene er magnetisk skilt og kastet. Denne metoden er fortrinnaktig for små molekyler, fordi det ikke krever immobilisering eller merking av målmolekylet for å oppnå separasjon.
Aptamerer som er i stand til struktur-svitsjing ha en verdifull egenskap for enhver potensiell biosensor plattform som krever en endring i aptamer struktur for å påvise tilstedeværelse av et målmolekyl. Nærmere bestemt, kan aptamerer kombineres med gull nanopartikler (AuNPs) for å skape assays som funksjon basert på struktur-bytter prinsippet å produsere en kolorimetrisk respons i nærvær av målmolekyl etter salt utfordring 19,20. I en AuNP analysen, den enkelttrådet DNA (ssDNA) aptamer utgangspunktet adsorberes til AuNP overflaten og beskytter det mot salt utfordring. Tilstedeværelse av target induserer en konformasjonsendring i aptamer som eksponerer AuNP overflaten, noe som resulterer i en rød-til-blå fargeskift etter salttilsetningen. AuNP analyser har også vist seg å forsterke signalet, hvor mikromolar affinitet aptamers kan oppdage mål på nivåer størrelsesordener lavere enn dissosiasjonskonstanten (K d) 21. Denne funksjonen er spesielt attraktivt for små molekyl mål, hvor slektskap vanligvis spenner fra lav mikromolar til millimolare konsentrasjoner 1,15. Vanligvis er analyse også rask og relativt enkel å utføre, og oppmuntrer videre studier av aptamer-AuNP assays som biosensor deteksjons plattformer.
Målet med dette arbeidet er å gi en universalprotokoll for valg av struktur-bytte aptamerer til små molekyler for biosensing applikasjoner ved hjelp av stress markør kortisol som en representant molekyl. En AuNP biosensor deteksjon ordningen er av interesse på grunn av sin enkelhet av drift og kolo avlesning, men struktur bytte aptamerer gjelder for alternative sensing plattform utganger, for eksempel elektro 22 eller fluorescens 23 som også sørger for gjenkjenning via en endring i aptamer conformation på målet bindende. Sammenlignet med tidligere metoder, ble flere negative seleksjons skritt innlemmet i design 17,18, og en enkel UV-basert berikelse deteksjon ordningen ble innført (figur 1). Denne protokollen er i kontrast med radioligand berikelse deteksjon ordningen brukes i eldre metoder 17. Den foreslåtte fremgangsmåte også innlemmet en økning i lengden av cDNA oppfangingsprober som brukes i valget for å øke effektiviteten partisjonering og effektivt tune stringensen av markeringen etter maksimal anrikning ble observert 24. Den avstemte stringens føre til en lavere total prosentandel av DNA elueres ved målet i den endelige bassenget, men resulterte i høyere kopiantall av en sekvens som er bundet med forbedret affinitet i forhold til den høyeste kopitall-sekvens fra en tidligere runde. Den høyeste kopitall-sekvens fra det endelige bassenget ble påført på en AuNP assay for å illustrere at sekvensen var mottagelig for en plattformsom krever en strukturell endring for å indikere mål bindende. Denne bufferen baserte analysen viser at responsen fra AuNP analysen kan modifiseres ved å endre densiteten av DNA påført på overflaten, og tjener som bevis-for-prinsipp arbeid å vie fremtidige forskningsinnsats mot å utvikle lite molekyl aptamer-baserte AuNP biosensorer i fysiologiske væsker.
Protocol
1. Bibliotek og Primer Design og syntese
- Designe den første bibliotek og primere (dette emnet har blitt anmeldt mye i tidligere publikasjoner) 25,26.
- Syntetisere følgende sekvenser for denne studien ved hjelp av standard fosforamidittkjemi:
Bibliotek: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
Forward Primer: GGAATGGATCCACATCCATGG
Omvendt Primer: Biotin-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA - Designe cDNA oppfangingsprober å være komplementær til 5'-regionen i biblioteket. Velge den første lengde ved analyse av nettet smeltetemperatur programvare for å tilveiebringe en smeltetemperatur noe over romtemperatur, og hver etterfølgende basis forsyne en øket smeltetemperatur.
mer Capture Probe: CCATTCC-Biotin
mer Capture Probe: TCCATTCC-Biotin
mer Capture Probe: ATCCATTCC-Biotin
- Syntetisere følgende sekvenser for denne studien ved hjelp av standard fosforamidittkjemi:
- Rense biblioteket ved standard HPLC. Avsalting er tilstrekkestrekkelig for primere og oppfangingsprober. Rekonstituere oligonukleotider i nuklease fritt vann ved den ønskede konsentrasjon og oppbevares ved -20 ° C i opptil flere måneder.
2. Buffer, Bibliotek, og Prøvepreparering
- Forbered 500 ml buffer i Millipore eller nukleasefritt grade vann med konsentrasjoner på 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4. Filtrer bufferen gjennom et sterilt 0,2 pm membran; lagring er mulig ved omgivelsesbetingelser for måneder.
- Alternativt kan bruke andre buffere så som PBS (fosfatbufret saltvann), HEPES (4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre), etc.
- Sette opp to thermomixers; sette en til 95 ° C og holde den andre ved omgivelsesbetingelser (~ 20 ° C i dette arbeidet). Forberede en isbøtte.
- Varme / snap kjøle DNA-biblioteket ved å plassere 100 ul bibliotek (~ 2,5 nmol for 10 15 -10 16 sekvenser) i Thermomixer satt ent 95 ° C i 5 min. Plasser røret på is, mens de magnetiske kuler fremstilles (avsnitt 3.1 til 3.6). Bestemme den virkelige konsentrasjonen av DNA-bibliotek ved hjelp av UV-absorpsjon ved λ = 260 nm og anvendelse av det passende omregningsfaktor for biblioteket.
- Klargjør mål stamløsninger i et medium som passer for målet oppløselighet.
- Forbered 100 mm analyttdata aksjer i DMSO. Disse bestandene er levedyktig for ca 1 måned når oppbevart ved normale forhold, men forskjellige mål vil demonstrere ulike nedbrytnings profiler.
3. Utarbeidelse av Magnetic Perler og Innledende runde av Utvalg
- Vortex 6.7 x 10 8 kuler / ml streptavidin-belagte magnetiske perler og fjerne 400 pl i et nytt mikrosentrifugerør. Plasser røret på magneten i 2 minutter og fjerne supernatanten.
- Vask kulene ved tilsetning av 400 ul av bindingsbuffer, vortexblanding, og aspirering av supernatanten etter å plassererøret på magneten for å separere perlene. Gjenta denne prosessen tre ganger.
- Immobilisere capture probe på de magnetiske kuler ved å resuspendere kulene i 400 ul bindingsbuffer med 50 pM (slutt) capture probe og inkubering i 10 min med forsiktig omrøring på termomikser ved omgivelsesbetingelser.
- Vask perlene tre ganger med 400 mL av binding buffer ved å gjenta vaske trinnene som er beskrevet i kapittel 3.2 for å fjerne fri fangst sonde.
- Resuspendere kulene i 400 ul bindingsbuffer. Fjern 100 mL av perle løsning for de neste trinnene, og beholde de resterende 300 mL ved 4 ° C for å bruke for ytterligere valgrunder for maksimalt tre uker.
- Vask kulene to ganger med 200 ul av bindingsbuffer som beskrevet i avsnitt 3.2.
- Tilsett 100 ul av snap avkjølt DNA fra avsnitt 2.3 til de vaskede kulene og inkuberes i 30 minutter med forsiktig omrøring ved hjelp av termomikser ved omgivelsesbetingelser.
NOTE: DNA-konsentrasjoner i de første omgangene er høyere enn det etterfølgende runder for å minimere tap av sekvensen i tidligere omganger hvor unike sekvenser er teoretisk tilstede. - Kvantifisere DNA i supernatanten ved hjelp av UV-absorpsjon som i avsnitt 2.3 og subtrahere dette fra det første mengde tilsatt i avsnitt 3.7 for å vurdere mengden av DNA bundet til kulene.
- Vask kulene med 200 ul bindingsbuffer etterfulgt av to ytterligere vaskinger med 200 ul bindingsbuffer med forsiktig omrøring på en termomikser i 5 minutter ved omgivelsesbetingelser.
- Resuspendere kulene i 200 ul av 100 uM target fortynnet i bindingsbuffer, og rotere på termomikser i 30 minutter ved omgivelsesbetingelser. Forbered arbeidsløsninger frisk ved begynnelsen av hver dag før valg fordi målet og kontroll ble observert til å aggregere med vandig oppløsning over tid. Ta vare på supernatanten oppløsning som inneholder target-sekvensen eluerts for videre studier.
- Utfør negativ seleksjon etter fullføring av 1-2 runder ved å tilsette 200 pl av 1 pM progesteron til kulene fremstilt i seksjon 3.8.1. Rist forsiktig i 30 min på termomikser ved omgivelsesbetingelser.
- Bruk magnetisk stativ for å fange kulene og kast supernatanten, vasking av perlene to ganger i 200 ul bindingsbuffer før kortisol tilsetning som i avsnitt 3.9.
4. Enrichment Overvåking, PCR, og Single-strandet DNA Generation
- Legg den overliggende oppløsning til en dialyse kassett for å overvåke valg anrikning. Dialyse er nødvendig å fjerne kortisol fra den eluerte DNA fordi kortisol er tilstede i mye høyere konsentrasjoner enn DNA, og har også en UV-absorpsjonstopp som overlapper standard DNA UV λ max = 260 nm.
- Utføre dette trinnet annenhver runde (runder 2, 4, 6, og 8) i de tidlige rundene av utvalget. Dette reduserer prøve loss når potensielt få kopiantall for hver sekvens er tilstede (høyest mangfold). For raskere resultater, kan alternative metoder som størrelseseksklusjonskolonner anvendes også.
- Dialyser kassett med prøven i frisk 250 ml bindingsbuffer i 2 timer ved omgivelsesbetingelser to ganger. Erstatte buffer og inkuberes ved 4 ° CO / N.
- Analyser dialysert bassenget ved UV-spektroskopi for å bestemme prosenten av DNA elueres ved målet (sammenlignet med resultatene fra avsnitt 3.8).
- Forberede en 3% agarosegel med 1% w / v ethidiumbromid. I dette arbeidet fremstille en gel fra 1,5 g agarose, 50 ml TAE buffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA, pH = 8,0), og 10 ul av etidiumbromid.
- Syklus-optimalisere dialysert bassenget ved å utføre en liten skala PCR (5 x 50 mL alikvoter) ved hjelp av ~ 5 til 15 sykluser. For PCR komponenter, bruker 1x PCR-reaksjonsbuffer (alle sluttkonsentrasjoner), 200 uM dNTP, 10% reaksjonsvolum på DNA-templat, 500 nm hver primer og 2,5U-polymerase (2,5 U / ul stam).
- Run PCR ved anvendelse av optimaliserte betingelser ved 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av gjentatte sykluser av 95 ° C (30 sek), 55 ° C (30 sek) og 72 ° C (1 min), og deretter en 72 ° C (10 min) endelig forlengelse og hold ved 4 ° C.
- Ansett en 25 bp standard stigen for sammenligning og visualisere på en gel imager. Velg antall sykluser som gir høyest intensitet bandet i riktig størrelse markør uten uønskede biprodukter.
- Analysere resultatene av syklusen optimalisering ved å kombinere 10 ul av hvert PCR-syklus med 2 ul av 6x blå / orange lasting fargestoff, og legger inn i 5 separate brønner i 3% agarose gel fremstilt i trinn 4.4 (125 V i 45 min).
- Utføre en stor skala PCR utnytte forholdene og riktig syklus nummer fastsatt i punkt 4.5. Vanligvis 6-8 ml PCR reaksjoner ble pålagt å skaffe 1-2,5 nmol brukes for hver runde i dette valget. Bruke 8-stavs rør for å forenklehåndtering av de mange rør som kreves for å alikvot av dette volum for PCR-amplifikasjon.
- Forberede en 3% agarosegel som beskrevet i avsnitt 4.4, og validere at PCR produkt bandet vises på riktig sted å følge trinnene i §§ 4.5.2-4.5.3.
- Konvertere hele dobbelttrådet DNA produkt fra avsnitt 4.7 til enkelttrådet DNA av trinnene som er beskrevet nedenfor:
- Legg 300 ul streptavidin-kuler (ikke magnetisk) til en liten kolonne blokkert av frits. Vask kulene med 5 ml bindingsbuffer ved å feste en luer-lock sprøyte og påføring av et lett trykk til stempelet. Fjerne sprøyten fra kolonnen og fjerne stemplet fra sprøyten off-line etter tilsetting av hvert materiale slik at kulene ikke blir forstyrret av stempelet aspirasjon.
- Legg PCR produkt og passerer det gjennom kolonnen ved hjelp av milde press på stempelet. Bruke flere søyler, slik at ikke mer enn 1 til 1,2 ml av PCR-produktet blir tilsatt til hver kolonne. Kast den endelige flow gjennom siden DNA vil bli bibeholdt på kolonnen av biotinrest på den anti-sense tråden.
- Vask kolonnen med 5 ml bindingsbuffer.
- Dehybridize DNA ved tilsetning av 0,5 ml 0,2 M NaOH. Beholder eluatet som inneholder den enkelkjedete sens DNA.
- Avsalte ssDNA i 0,2 M NaOH ved tilsetning av 0,5 ml til en avsaltingskolonne fremstilt ved en vask med nuklease fritt vann. Kast den opprinnelige 0,5 ml væske, deretter legge en ml nuclease gratis vann og samle dette avsaltet ssDNA prøven. Bruken av flere kolonner avsaltings vil være nødvendig for hver 0,5 ml porsjon.
- Bestemme konsentrasjonen av DNA elueres ved UV-absorpsjon ved λ = 260 nm.
- Vakuum tørke prøven og rekonstitueres i en egnet volum av bindingsbuffer. Hvis det ikke var nok DNA innhentet for neste runde av valget, gjenta deler 4.6-4.9.2.
5. påfølgende runder av markering og Sequencing
- Juster nivåene av seleksjonsbetingelser avhengig av resultatene av anrikning overvåking (avsnitt 4.1). Vanligvis gjør forholdene strengere i påfølgende valgrunder for å velge den høyeste affinitet bindemiddel fra bassenget.
MERK: Dette kan omfatte en kombinasjon av å øke DNA-konsentrasjon, øke antall, tid eller volum av vasketrinn, redusere den bestemte konsentrasjonen, å øke konsentrasjonen av den negative velgeren forbindelse, eller en rekke andre fremgangsmåter for 27.- Anvende egnede kontroller som er hensiktsmessig for å sikre spesifisiteten av sekvensene for målmolekylet. I dette arbeidet, gjelder en negativ seleksjon molekyl (progesteron) til systemet (tabell 1) begynner i runde 3 og øker i konsentrasjon gjennom hele utvalget. Fra og med runde 11, pre-inkubere DNA pool i 30 minutter med 10-20 pM progesteron før immobilisering av kulene (før avsnitt 3.7). Øke lengden på opptaks proben etter maksimal anrikning observeres.
- Forberede den endelige basseng (runde 15) og andre bassenger som representerer maksimalt beriket (runde 13) og minimalt beriket (runde 6) betingelser for sekvensering av PCR forsterkning med kompatible primere og en high fidelity polymerase.
- Sett opp en 50 pl reaksjons volumet med sluttkonsentrasjoner på 1x (reaksjon buffer), 200 um (hver dNTP), 400 nM (hver primer), 0,5 mL av DNA basseng, og 0,5 mL av polymerase. Syklus optimalisere for hver runde ved hjelp av fremgangsmåten under punkt 4.5 bruker de samme PCR-forhold med unntak av en 7 min venting ved 72 ° C for den endelige forlengelse.
- Send 50 mL av de preparerte bassenger til en sekvense anlegget i mikrosentrifugerør med caps grundig forseglet med ikke-klebende wrap. Plasser rørene i en 15 ml konisk rør pakket med bobleplast og skip O / N med isposer til sekvense anlegget.
- Bestemme kopiantallet for hver sekvens for å vurdere anrikning av sekvens bassenget (e).
- Bruk kode skriving / sortering trinn (Se tilleggskode File) for neste generasjons sekvense data i FASTA format å bestemme frekvens / kopiantall for hver sekvens gjentatt i dataene for alle bassenger levert av sekvense anlegget:
- Analyser spesifisitet og affinitet av de høyeste kopi tallsekvenser. Den type interaksjon (protein eller lite molekyl), strukturelle egenskaper av aptamer ved binding, og forventet affinitet vil diktere hvilken metode som er hensiktsmessig. Dette emnet er i et antall referanser 1,28-30 anmeldt nærmere.
6. AuNP Syntese og Detection
- Syntetisere AuNPs bruker citrate reduksjon metode 21. Bland 98 ml Millipore vann med 2 ml 50 mM HAuCl 4 og oppvarm til koking.
- Tilsett 10 ml 38.8 mM natriumsitrat somsnart reflux begynner. Fargen vil endre seg til en rød farge etter noen minutter. Fortsett omrøring av oppløsningen i 20 min med varmen.
- La AuNP løsningen å avkjøles til romtemperatur og deretter filtrere gjennom et 0,2 um polyestermembran. Lagre alle AuNP suspensjoner i en mørk rav flaske.
- Beregn AuNP konsentrasjon ved UV-absorpsjon, ved hjelp av ekstinksjonskoeffisient på 2,4 x 10 8 l mol -1 cm -1 31. Konsentrasjonen var 10 nM i dette arbeidet, med en størrelse på 17 ± 0.6 nm bestemt av dynamisk lysspredning 21.
- Inkuber DNA med 10 nM AuNP i 1 time ved omgivelsesbetingelser beskyttet med aluminiumsfolie. Variere volumet av AuNP å gi nok oppløsning til å tillate alle ønskede tester som skal utføres (~ 1-2 ml). Lasting tettheter på 73, 120, og 200 D / NP (DNA-molekyler per AuNP) ble undersøkt i dette arbeidet, og volum og konsentrasjon vil variere tilsvarende.
- Fortynn DNA / AuNP oppløsning på 1: 1 ved anvendelse av HEPES-buffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH = 7,4). Tillat blandingen å stabilisere seg ved RT dekket av aluminiumsfolie.
MERK: Tiden som kreves for dette trinnet må optimaliseres av forskeren. I dette arbeidet tider som strekker seg fra flere minutter til O / N ble undersøkt. - Forbered analytt (kortisol, cholsyre, 2-metoksynaftalen) stamløsninger på 100 mm i DMSO og dekk med aluminiumsfolie. Lage fersk innledende løsninger før hvert forsøk ved utvanning av aksjen til 100 mikrometer i en 1/3 fortynning av kortisol bindingsbuffer (punkt 2.1). Ytterligere fortynne den opprinnelige løsning med 1/3 bindingsbuffer slik at et konstant volum (10 ul) av målet blir tilsatt for å generere et område av konsentrasjoner.
- Optimalsaltkonsentrasjon som er nødvendig ved å tilsette 80 ul av DNA / AuNP løsning med 10 ul bindingsbuffer 1/3 (referert til som "blank").
- Inkuber i 20 min ved RT og deretter legge forskjellige volumer av NaCl solution. Se for volumet av saltet som induserer en knapt merkbar endring visuelt mot en blå fargetone etter salttilsetningen (13 til 40 ul av 1 M NaCl brukes i dette arbeidet). Dette gir et godt utgangspunkt, men kan trenge ytterligere justering følger resultatene inkludert målet tillegg.
- Kombiner 80 ul av DNA / AuNP løsning med 10 ul av mål-løsning og inkuberes i 20 min ved RT. Utnytte en 96-brønns plate og multikanalspipette å analysere flere målkonsentrasjoner samtidig, alltid inkludert en blank (§ 6.8).
- Tilsett passende mengde av NaCl-oppløsning (13 ul av 1 M NaCl ble anvendt i dette arbeid) og umiddelbart analysere absorbans ved 650 og 530 nm ved anvendelse av en plateleser.
- Plott resultatene som forholdet mellom absorbans-verdier (E 650 / E 530) i forhold til target-konsentrasjon normalisert i forhold til den tomme måle.
Representative Results
Nivåene av forholdene ble opprinnelig holdt lav for å beholde permer stede i lave kopiantall i de første rundene. Den første runden, særlig implementert lavest stringens for å bevare bindemidler vanligvis presentert som unike sekvenser, demonstreres ved den høye kortisol og DNA-konsentrasjoner, og den manglende negative seleksjonstrinn. Suksessen til denne aptamer utvalget er demonstrert av utviklingen av bassengene fra en lav prosentandel eluert ved målet (runde 2) til en høyere andel eluert ved målet som holder seg relativt konstant i rundene 12-13 (tab 1). Dette platået av DNA elueres ved målet er tradisjonelt et endepunkt i utvalget ("berikelse"). Men denne fremgangsmåten videre hevet stringensen av markeringen etter anrikning ved å øke lengden av cDNA-capture probe (Figur 1). Forlengelse denne proben øker styrken av hybridiseringen mellom CDNA og bassenget, øker smeltetemperaturen (T m) av komplekset, og som krever en sterkere vekselvirkning mellom target-sekvensen og for å frigjøre de bindende sekvenser i løsning. Den første seleksjonsrunde implementert en svakere interaksjon cDNA på grunn av en mindre G base på 5 'enden av biblioteket. Dette er i tråd med generelt lavere stringens i første runde, og forventes ikke å ha betydelig innvirkning på valg annet enn ved at flere potensielle bindemidler samt bakgrunns sekvenser (dehybridize basert på termodynamikk) for å gå til neste valgrunde. Disse bakgrunns sekvenser ble minimert som utvalget fortsatte mot berikelse ved å implementere høyere stringens i påfølgende valgrunder. Når cDNA ble forlenget fra en 7-mer til en 8-mer i runde 14, er prosenten av DNA elueres ved målet redusert fra 15,3% til 11,1% for en T m øket fra 19,2 ° C til 26,7 ° C. CDNA wsom ytterligere utvidet til 9-mer i runde 15 med en T m av 31.3 ° C, faller det totale eluert til 3,3%.
Ytterligere informasjon om berikelse kan fås ved å sekvensere flere bassenger, både beriket og ikke-beriket eksempler, for å spore utviklingen av bassengene i hver runde. Neste generasjons sekvensering (NGS) har dukket opp som en kraftig metode for sekvensering i utvalget, hovedsakelig fordi høyere sekvens leser (totalt antall sekvenser rapportert) oppnås i forhold til Sanger-sekvensering. Disse høyere sekvens leser presentere et større dekning av det totale antall sekvenser i bassenget, noe som gir et mer fullstendig bilde av mangfoldet i sekvenser. NGS fjerner også kloning skjevhet 32, og gjør det mulig for sekvensering av flere bassenger i en enkel batch med tillegg av strekkoder 24,33. NGS ble brukt til å analysere utviklingen av berikelse fra tre separate bassenger i dette utvalget utvalget (figur 2). Bassengerfra runde 6 (liten berikelse i forhold til runde 2 av% elueres), runde 13 (høyest berikelse), og rundt 15 (høyeste stringens) ble valgt som representative punkter av utvalget. De kopiantall for hver unik sekvens ble plottet som en prosentandel av det totale antallet av sekvens leser for hver pool. Toppen rangert (høyest antall kopier) sekvens bare utgjorde 0,1% av alle sekvenser i runde 6 (33 435 totalt sekvenser, 22 463 unike sekvenser). Ettersom bassenget blir maksimalt beriket i runde 13, til de beste rangert sekvens øker utgjør 15,4% av hele bassenget (17 681 totalt sekvenser, 2987 unike sekvenser), 150x høyere enn i runde 6 til tross for bare en ~ 5x økning i berikelse observert ved UV . Runde 15 (28.919 total sekvens lyder: 2980 unike sekvenser) hoppet til 44,9% av alle sekvensene representert ved den enkelt topp rangert rekkefølge, selv om UV berikelse overvåkning viste at mengden eluert ved målet var ~ 5x lavere enn for rund 13 ( Tabell 1
15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
Tidligere studier undersøkte binding av disse to sekvenser av mikro thermophoresis og likevekt dialyse 24. Resultatene viste signifikant kortisol bindende for sekvens 15-1 (K d = 6,9 ± 2,8 mikrometer ved likevekt dialyse; 16.177; 0,6 pM til mikro thermophoresis) mens minimal binding ble observert mellom kortisol og sekvens 15-3. Dette viser at den økte lengden på fangst sonde i runde 15 hjulpet i å tilby høyere ente betingelser for å analysere ut høyere affinitet bindemiddel. I tillegg har ingen av sekvensen vist observerbar binding til det negative seleksjons molekyl, progesteron, som viser at tilsetningen av de negative seleksjonstrinn var fordelaktig for fremgangsmåten.
Det faktum at en høyere affinitet bindemiddel fremkom følgende maksimal anrikning (bestemt ved den tradisjonelle metode for å analysere prosenten av DNA elueres ved målet) etter forhøyede stringensbetingelser ble anvendt i ytterligere runder med seleksjon validerer fremgangsmåte for å utvide lengden av cDNA-fangst sondere etteranrikning. Dette resultatet viser at kopiere nummer fra en sekvens basseng og affinitet for målet kan bare være tilknyttet under visse betingelser 24,34, i contrast med en tidligere rapport som innebærer en direkte sammenheng 35. Det fremhever også fordelen av overvåking berikelse av NGS, snarere enn utelukkende av% elueres strategi vanlig i de fleste valg, som kan variere naturlig fra en runde til den neste som høyere ente betingelser brukes. Imidlertid er% elueres nyttig for overvåking berikelse når lignende forhold brukes over flere runder. For eksempel, runder 6-10 alle involverte lignende forhold, med ingen signifikant endring i berikelse (tabell 1). Når dette er observert over flere runder, forholdene er sannsynlig for strenge for å fremme berikelse, og forskeren bør redusere stringens i neste runde. For eksempel, ble kortisol konsentrasjonen økte fra 35 til 100 mikron i runder 11-13, og% eluert økt fra 2,5% i rundt 10 til 14,5% i runde 12. Derfor% eluerte kan tjene som en rettesnor for å justere stringens i løpet av et utvalg når Similar vilkår sammenlignes fra runde til runde, og kan gi utfyllende informasjon til NGS for å bestemme et utvalg endepunkt.
Sekvens 15-1 ble påført på en AuNP analyse for å bestemme om en sekvens utvalgt på en slik måte for å frembringe en struktur veksling aptamer ville fungere i en analyse som er basert på en strukturell forandring følgende mål binding for å frembringe et svar. Tidligere innledende studier viste at AuNP analysen med 15-1 svarte til stress biomarkør kortisol, men ikke til andre to markører for stress, adrenalin og noradrenalin, eller cholsyre, til en markør av leversykdom strukturelt like kortisol 24. Responsen ble observert i normalområdet av fritt kortisol rapportert i humant serum (~ 150-600 nM) 6, validere at aptamer valgt for en strukturell endring på kortisol bindinger produserer en respons i AuNP analysen. I denne nåværende arbeid, ble karakterisering av systemet tatt ett skritt videre ved å justeredekning (densitet) på 15-1 på AuNP overflate. Ved å bruke samme sett av betingelser, ble DNA-dekning økes fra 73 D / NP (DNA-molekyler / AuNP), 120 D / NP og 200 D / NP (figur 3). Cholsyre produseres en minimal respons, med unntak av 10 uM ved 200 D / NP. Responsen av analysen redusert som dekningen ble øket som gjorde deteksjonsgrensene (LOD). LOD var 29,5 nM for 73 D / NP, 145,2 nM for 120 D / NP, og 27,3 mikrometer for 200 D / NP. Dette resultatet er enig med arbeidet til Smith et al., Som illustrert at responsen av en AuNP assay utnytte kokain aptamer redusert når aptamer dekningen ble økt fra 60 D / NP til 300 D / NP 36. Dette innebærer at registreringsområdet for målet av interesse kan justeres basert på optimalisering av DNA overflatedekning i AuNP analysen. Dette kan være fordelaktig når man sammenligner for eksempel området fra fri kortisol i humant serum (~ 150-600 nM) mot humant spytt (~ 5-25 nM) <sup> 6,37. Mens fysiologiske væsker er langt mer kompleks enn denne bufferen analysen, resultatene gir en forlengelse på proof-of-prinsippet arbeid viser at AuNP forholdene kan justeres avhengig av programmet, og at videre arbeid mot å utvide medium til biologiske væsker ville være av interesse for biosensor samfunnet.
Figur 1. Oversikt over struktur-koblingsvalgmetode. En liten biotinylert cDNA capture probe blir immobilisert på streptavidin-belagte magnetiske kuler. CDNA er komplementær til 5'-regionen av biblioteket, hybridisering av biblioteket til kulene. Når target er tilsatt, blir en konformasjonsendring indusert til å frigi bindende sekvenser fra vulsten, slik partisjone lettes ved å anvende en magnet. Supernatanten blir beholdt for å overvåke anrikning (% DNA elueres ved the målet) ved UV etter dialysering av målet fra DNA. Dette trinn er bare nødvendig når målmolekylet absorberer i det samme UV-området som DNA. Sekvenser er så PCR forsterket og forberedt for neste runde av valget. Som det merkede skrider frem, blir negativ seleksjon anvendt, hvor sekvenser eluerte ved negativ seleksjon molekylet blir forkastet, og perlene med potensielt mål bindemidler blir deretter inkubert med målet. Lengden av cDNA proben økes etter maksimal anrikning (% eluert) for å øke stringensen av utvalget. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra 24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Round | [Kortisol] (mikrometer) | [Progesteron] (mikrometer) | Bundet DNA (pmol) | % Eluert av Target | cDNA Lengde |
| 1 | 100 | 0 | 357,57 | N / A | 7-mer |
| 2 | 50 | 0 | 145,49 | 1.4 | 7-mer |
| 3 | 50 | 1 | 188,74 | N / A | 7-mer |
| 4 | 50 | 5 | 336,4 | 2.3 | 7-mer |
| 5 | 35 | 5 | 88,05 | N / A | 7-mer |
| 6 | 35 | 10 | 303,89 | 3.1 | 7-mer |
| 7 | 35 | 10 | 255,01 | N / A | 7-mer |
| 8 | 35 | 10 | 236,81 | <td> 2.17-mer | |
| 9 | 35 | 10 | 318,95 | 2.6 | 7-mer |
| 10 | 35 | 10 | 297,18 | 2,5 | 7-mer |
| 11 | 100 | 10 | 147,61 | N / A | 7-mer |
| 12 | 100 | 10 | 154,36 | 14.5 | 7-mer |
| 13 | 100 | 10 | 150,39 | 15.3 | 7-mer |
| 14 | 75 | 20 | 247,71 | 11.1 | 8-mer |
| 15 | 50 | 40 | 409,63 | 3.3 | 9-mer |
Tabell 1. Utvalg progresjon og berikelse av% eluering 24 < strong>. N / A (Not Applicable) er rapportert for runder der dialyse / UV berikelse overvåking ikke ble utført i begynnelsen av valgrunder for å redusere tap av lav kopitallsekvenser. Denne tabellen er gjengitt med tillatelse fra 24.
Figur 2. Utvalg berikelse bestemt av neste generasjons sekvensering (A) Runde 6.; (B) Runde 13; (C) Runde 15. Sekvenser ble rangeres etter å kopiere nummeret. Den høyeste kopiantall sekvens økes fra å utgjøre en lav prosentandel av hele sekvensert bassenget i runde 6 (0,1%) til en høy prosentandel i runde 15 (44,9%) som bassenget ble anriket for kortisol bindende sekvenser. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra 24.et = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. AuNP assay respons fra varierende aptamer 15-1 dekning. Tettheten av aptamer inkubert med AuNPs ble økt fra 73 D / NP (rød trekant), 120 D / NP (grønn firkant) og 200 D / NP ( blå sirkel). Kortisol reaksjoner er sterke farger, er cholinsyre respons i lyse farger. Analysen responsen forbedres for kortisol ved lavere tettheter, og dermed senke LOD og rekkevidde målet kan detekteres innenfor. Forholdene med høyest kortisol respons (73 D / NP) ble karakterisert ytterligere i lineære området for å gi flere poeng innenfor den forventede normalområdet av fritt kortisol rapportert i humant serum (~ 150-500 nM) og spytt (5-25 nM ) 6,37. Den minimale responsen cholsyre anvende de samme 73 D / NP forholdene har væreno beskrevet i tidligere arbeid 24. Alle tomter representerer gjennomsnitt ± SEM for dupliserte eller tredoble målinger.
. Figur 4. Representative resultater fra PCR syklus optimalisering Fra venstre til høyre brønnene representerer: 4 sykluser, 6 sykluser, 8 sykluser, 10 sykler, 12 sykluser, negativ (ingen DNA mal), 25 bp DNA ladder standard. Optimale forhold er observert på 8 sykluser, hvor enkelt produkt bandet er på høy intensitet uten over forsterkning produkter stede ved høyere sykluser.
Figur 5. AuNP assay inkubasjonstid optimalisering. Inkubasjonstiden for AuNP / DNA-trinn ved 73 D / NP ble redusert fra O / N (figur 3) i 30 min, og målet incuvestand ble umiddelbart etterfulgt av salttilsetningen i stedet for etter 20 min (Figur 3). (A) En respons observert for kortisol (blå diamanter), men ikke for cholsyre (grønne sirkler) eller 2MNP (2-metoksynaftalen, røde firkanter). Alle tomter representerer gjennomsnitt ± SEM for dupliserte eller tredoble målinger. (B) Fra venstre til høyre: blank, 10 mm kortisol, 10 mm cholsyre, 10 mikrometer 2MNP. Visuell endring kan observeres med det blotte øye for kortisol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det faktum at små molekyler som er av biologisk interesse, men utgjør bare 19% av alle aptamerer rapportert gjengir fremgangsmåter utformet for å velge aptamerer som er anvendelig på små molekyler av stor betydning. SELEX av små molekyler er spesielt utfordrende som færre funksjonelle grupper, strukturelle motiver, og arealet er tilgjengelige for interaksjon med sekvenser i forhold til proteiner en, og det har blitt anslått at mindre enn 30% av valg for alle mål forsøkt har resultert i en aptamer 38. Derfor må man være svært oppmerksom på eksperimentell design og utførelse for å kunne velge en aptamer til et lite molekyl mål.
Den aptamer valgmetoden beskrevet i dette arbeidet er fordelaktig fordi den kan anvendes på små molekyler uten å kreve noen kjemisk modifikasjon som kan endre sine bindende egenskaper. Det er også eluering basert, noe som betyr at siden tHan DNA, snarere enn målet, blir først bundet deretter eluert fra magnetiske kuler etter målet, DNA som samvirker med vulsten matrisen vil ikke bli forsterket for neste seleksjonsrunde fordi bindemidler til molekylet av interesse blir sluppet ut i supernatanten buffer og uspesifikke matrix permer forbli bundet. Omvendt er en negativ-utvelgelsesmetode mot matrisen som er nødvendig for fremgangsmåter som immobiliserer målet til den faste bærer hver runde fordi DNA som samvirker med matrisen vil bli amplifisert i tillegg til mål-bindemidler 1. Den nåværende metoden ble utviklet som en T m begrenset utvalg strategi. Dette betyr at T m av cDNA / pool hybridisering ble holdt nær romtemperatur. Morse benyttet en lignende strategi, men anvendt en 6-mer probe-cDNA med en T m <10 ° C med seleksjonsbetingelser ved 4 ° C 17. Vår søknad var for en biosensing assay utført ved romtemperatur, slik at lengden av cDNA ble justert i henholdly. Dette holder stringens av utvalget lav nok til at potensielle bindemidler ikke går tapt fordi målet bindende samspillet oppstår i et avsidesliggende sted som ikke induserer en konformasjonsendring i stand til å forstyrre cDNA bindende. Imidlertid er partisjone effektiviteten av den foreslåtte fremgangsmåte lav fordi noen sekvenser vil dehybridize utelukkende basert på termodynamikk. I motsetning til dette, Nutiu et al. Anvendt en 15-mer-cDNA, og var bare i stand til å identifisere aptamerer for to av de fire målene, muligens fordi T m av den 15-mer var for høy til å tillate en frigjøring av et lite molekyl target 18. Derfor, mens dagens utvalg strategi vil kreve mange runder for å fjerne bakgrunns sekvenser, ved å kontrollere stringens av utvalget og minimere tap av potensielle permer sannsynligheten for suksess vil bli økt.
Mange forskere nye til aptamer utvalg er uvitende om viktige aspekter knyttet til PCR avpotensielle permer. Syklus optimalisering (avsnitt 4.5) er nødvendig fordi over-amplifikasjon av DNA-biblioteker frembringer uønskede biprodukter (vanligvis større i størrelse) ved høye syklustall, og det ønskede produkt kan forsvinne helt med et overskudd av bare 5 sykluser 39. I tilfelle av over-amplifikasjon av PCR-produkter som ikke lenger representerer de sekvenser som eluerte ved målet, og sjansene for suksess valg blir betydelig redusert. Figur 4 illustrerer et eksempel på en syklus optimalisering fra rundt 5 i dette arbeidet. Den laveste syklus produserer en minimal produkt band, band øker i mengde gjennom åtte sykluser; 10 sykluser bandet begynner en overgang til en høyere størrelse over-amplifikasjonsprodukt, og er nesten utelukkende består av over-amplifisert produkt i løpet av 12 sykluser. En annen detalj som mange forskere uerfaren i SELEX kan overse er at hele bassenget må forsterkes i stor skala PCR forsterkning (punkt 4.6) i granst runde for å redusere tap av bindemidler. Antall unike sekvenser som mulig fra oligonukleotider er 4-N, hvor 4 betegner de fire nukleinsyrebaser, og N er antall baser i tilfeldig region av biblioteket. For dette arbeidet, N = 40, som resulterer i en sekvensene plass på 1,2 x 10 24 mulige unike sekvenser. Den 2,5 nmol av bibliotek som brukes i det første seleksjonsrunde tilsvarer ~ 10 15 molekyler, noe som betyr at hver kopi av DNA er sannsynlig representert i det første basseng som en unik sekvens. Derfor må hele volumet av DNA ble eluert fra kulene ved målet bli amplifisert for å beholde en kopi av hvert potensielle bindemiddel for neste seleksjonsrunde. Når denne første forsterkning har oppstått, flere kopier er tilgjengelig for valg i de neste rundene hvor en homogen løsning antas for prøvetaking.
Konsentrasjonen av målet bør også vurderes nøye i hver runde. Nutiu et al. Brukda konsentrasjon på 1 mM mål gjennom hele utvelgelsesprosessen, og valgt en ATP aptamer med K d = 600 mikrometer 18. Både nåværende arbeid og forskning av Morse 17 begynte med 100 mikrometer mål, avtagende i løpet av utvalget, og resulterte i aptamerer med lave mikromolare slektskap. Nøyaktig hvilke rundt stringens bør økes (lavere target konsentrasjon) avhenger av når berikelse er observert. Et annet kritisk punkt er å bruke riktige negative seleksjons skritt så aptamerer demonstrere spesifisitet til målet molekylet. Hvilke kontroller som er brukt er betinget av det tiltenkte formålet av den valgte aptamer. For eksempel ble aptamer 15-1 konstruert for å fungere som en gjenkjenningselementet i en biosensing assay for kortisol, slik at progesteron ble brukt som en negativ seleksjon molekyl, fordi det er en metabolsk forløper for kortisol som finnes i fysiologiske væsker 40. ATP aptamer valgt av Nutiu et al. </ Em> ikke inkluderte en negativ utvalg skritt, og samhandler med strukturelt lignende molekyler inkludert ADP, AMP, adenosin, og dATP 18.
En endelig notat for vurdering er at AuNP analysen krever ofte betydelig optimalisering for hver aptamer / target par. Looking for volumet av salt som induserer en knapt visuelt merkbar endring mot en blå nyanse etter salt tillegg er et godt utgangspunkt, men justering av startpunktet kan være nødvendig for å observere et svar. Man har også funnet at analysen gir drastisk forskjellige reaksjoner avhengig bufferkonsentrasjon (utvalget buffer kan kreve fortynning fordi den høye saltkonsentrasjonen av buffere fører ofte aggregering) og sammensetning, graden av DNA-dekning (figur 3), prøvepreparering (noen organiske løsningsmidler som brukes for å oppløse målet kan føre til en høy bakgrunn som maskerer målet respons), temperatur, salttype og konsentrasjon, og incubasjon tid (både DNA med AuNP og DNA / AuNP med target). Under fullt optimaliserte forhold, blir resultatet ofte observert med et mål inkubasjonstid <5 min, demonstrere til fordel for en rask målrespons av AuNP biosensing plattformen. For eksempel, i figur 5 inkubasjonstiden av aptamer / AuNP trinnet ble redusert fra O / N (figur 3) i 30 minutter, og saltet ble tilsatt umiddelbart (<10 sekunder) etter at målet tillegg heller enn 20 minutter senere (figur 3 ) ved en lastetetthet av 73 D / NP. Dette økte kortisol respons til ~ 82% høyere enn blindprøven (figur 5A) ved 10 uM målkonsentrasjon versus ~ 40% ved hjelp av de foregående betingelser (figur 3). Dette svaret kan skilles med det blotte øye (Figur 5B). Legg merke til at det lineære området av kortisol deteksjon er annerledes enn ved bruk av de tidligere betingelser, noe som tyder på at disse betingelser kan optimaliseres for en ønsketrekkevidden. Cholsyre og 2-metoksynaftalen (2MNP) kontroller ga ikke en signifikant respons (figur 5A-B). Forskere må være klar over at å redusere disse inkubasjonstid kan rette for økt respons av analytter med AuNP overflaten, som kan bidra til generell forbedret signal (mål) eller bakgrunnen (ikke-target molekyler). Derfor er nødvendig forsiktig AuNP analysen design og ytelse karakterisering for hver aptamer / target par.
Denne fremgangsmåten beskriver en protokoll for valg av små molekyl-struktur-veksling aptamerer som fungerer på en biosensing plattform slik som beskrevet AuNP assay, som krever en konformasjonell endring av DNA for å påvise nærvær av målet. Imidlertid kan denne metoden anvendes for andre biosensor systemer slik som elektrokjemisk eller fluorescens som fungerer på samme forutsetning for praktisk talt alle størrelser målet. Kraften av protokollen kan videreutvikles eksperimentelt vedflere tilnærminger. For det første kan det merkede seg selv potensielt bli forbedret ved å undersøke fremgangsmåter for optimalisering slik som å bestemme den ideelle T m av cDNA / bibliotek hybridisering som gir en vekselvirkning som er svak nok til å samvirke med et lite molekyl målet, men likevel sterk nok til å redusere mengden bakgrunns sekvenser dehybridized utelukkende fra termodynamikk. Dette vil kondensere antall sykluser er nødvendige for seleksjon og sparer tid i arbeidskraft og å redusere forbruket reagens. Ytterligere undersøkelser av modifikasjoner i valget vil være å bestemme de gunstigste konsentrasjoner av perler og DNA, slik at en mangfoldig populasjon av sekvenser er utsatt for målet, spesielt i den første runde. Suksessen til disse proof-of-prinsippet eksperimenter gi et grunnlag for å investere ytterligere ressurser til å optimalisere og tilpasse AuNP buffer analysen til fysiologiske væsker. Det er et legitimt behov for en rask, robust biosensing plattform som kan fuksjon som et diagnostisk verktøy av den fysiologiske tilstand til et individ, og videre utvikling av AuNP assay i humant serum, ville svette eller spytt møter en strøm av dette gap.
Disclosures
Distribusjon Statement A: Godkjent for offentlig utgivelse; distribusjon er ubegrenset (88 ABW-2014-4103). Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
| Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
| Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
| Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
| Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
| Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
| 500 ml Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
| All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers — desalted; Aptamers — HPLC |
| Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
| PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
| Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
| 10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
| GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
| Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
| Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
| Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
| Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
| Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
| Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
| SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
| HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
| 250 ml Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
| 5 ml Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
| ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
| 2-Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
| Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |
References
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).
- Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).
- Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress. Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).
- Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation. J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).
- Kwak, J., et al. Volatile biomarkers from human melanoma cells. J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).
- Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System. Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).
- Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor. Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).
- Kapczinski, F., et al. Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment. Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. Selection of an RNA domain that binds Zn2. RNA. 1 (5), 538-550 (1995).
- Liu, J., et al. Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue. PlosOne. 7, e37789 (2012).
- McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).
- Huang, L., et al. A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine. Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).
- Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Morse, D. P. Direct selection of RNA beacon aptamers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).
- Nutiu, R., Li, Y.
- Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem. Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).
- Li, H., Rothberg, L. J. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).
- Hagen, J. A., et al. Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation. Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).
- Han, K., Liang, Z., Zhou, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors. Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).
- Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Hall, B., et al. Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- Djordjevic, M. SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).
- Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. Targeting RNA with Small Molecules. Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).
- Jing, M., Boswer, M. T. A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).
- Sachs, E. -F., Diederichsen, U. Binding of Triostin Analogues to DNA. , AN NT008. (2011).
- Liu, J., Lu, Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).
- Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).
- Martin, J. A., et al. Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin. Plos One. 8 (3), e57341 (2013).
- Schütze, T., et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. Plos One. 6 (12), e29604 (2011).
- Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing. Plos One. 6 (5), (2011).
- Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -C., Hudgens, G. A. Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).
- Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. Plos One. 5 (12), (2010).
- Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).
- Wiebe, J. P.
