Анализ аутофагии в<em> Пеницилл золотистый</em> С помощью голодания колодки в сочетании с флуоресцентной микроскопии

Summary

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Abstract

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introduction

Нитчатых грибов являются Отличная модель системы для изучения процессов развития. Они предлагают несколько экспериментальных преимущества, как дешевый выращивания, высокой численности потомства и генетического доступности. Последний пункт имеет особое значение для строительства трансформантов, что позволяет исследовать важность так далеко охарактеризованных генов для различных клеточных механизмов. Мицелиальных грибов играют важную роль для выяснения нескольких элементов и механизмов клеточных путей контроля качества, как активность протеазы для деградации аберрантных белков, митохондриальная динамики для поддержания митохондриальной целостности и аутофагии для удаления излишков и / или компонентов неблагополучных клеток и для поддержания Жизнеспособность клеток во время голодания ^1,2,3.

Есть несколько экспериментальных методов, доступных для изучения аутофагии в нитчатых грибов ^2: (I) Исследование вакуолей яF они содержат плотные тела, когда аутофагической протеазы ингибирует помощью просвечивающей электронной микроскопии ^4, (II) визуализация аутофагосом по мониторингу GFP-Atg8 очаги с помощью флуоресцентной микроскопии ^5,6 и (III) обнаружения подкисленных autophagosomal структур с помощью монодансил кадаверин флуоресцентный краситель ^7.

Здесь новый метод выращивания Пеницилл золотистый для аутофагии исследований представлены. Основным элементом является "голодание колодок ', который просто состоит из 1% агарозы, растворенного в стерилизованной водопроводной воды. Дополнительные соединения (например, стресс-факторы, поглотители, автофагии модуляторы) могут быть добавлены к площадке, пока они не показывают автоматического флуоресценции. Накладка находится в микроскопических слайдов, которые содержат неполную центральную полость. Это колодок в инокулировали либо суспензией спор или небольших фрагментов мицелия. Последнее целесообразно, если штамм не в интересах sporulatе эффективно (например, штаммы ГПТ1 Δ ^8). Слайды расположены во влажных камерах (они могут быть легко сконструированы с использованием пипетки пустые коробки), чтобы предотвратить высыхание образца и инкубировали при комнатной температуре. П. chrysogenum может расти в течение нескольких дней в этих условиях. Аутофагия можно наблюдать микроскопически вакуолярной расширения, которая положительно маркер для грибковой аутофагии. В данной статье, в P. chrysogenum Штамм (Висконсин 54-1255) используется, который формирует зеленый флуоресцентный белок, который предназначен для пероксисом его С-концевого "СКЛ" последовательности ^9. Поэтому можно контролировать деградацию пероксисом. Вполне возможно, для обозначения и другие отсеки клетки (например, митохондрий), используя соответствующие сигналы локализации и проанализировать их деградации. Хотя, по данным P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) представлена ​​здесь, это, конечно, возможноиспользовать метод «голод Pad 'и для других нитчатых грибов (например, Нейроспора густая, Sordaria macrospora, виды Aspergillus, и т.д.).

Protocol

1. Подготовка P. chrysogenum для голодания экспериментов Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на рисе ("зеленая рисовая '), поместить 2-3 рисовые зерна, покрытые спорообразующих мицелий в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Заполните его 500 мкл YGG (10 г / л KCl, 20 г / л глюкозы, 10 г / л дрож…

Representative Results

Чтобы продемонстрировать полезность протокола описано выше деградации пероксисом в P. chrysogenum Штамм Ws54-1255 (GFP-SKL) анализировали. В этом штамме GFP-SKL, как правило, импортируются в пероксисомах 9. Это приводит к появлению множества сферических форм, когда образец анализируют с помо?…

Discussion

Метод, представленный здесь позволяет удобно и воспроизводимый исследование аутофагии в Р. chrysogenum. Например, он может быть использован для скрининга эффективности различных соединений, являются ли они способны модулировать аутофагии реакцию этого гриба или нет. Результаты с рапа…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 – 0.50 mm