Analisi di autofagia in<em> Penicillium chrysogenum</em> Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

Summary

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Abstract

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introduction

Funghi filamentosi sono ottimi sistemi modello per lo studio dei processi di sviluppo. Essi offrono diversi vantaggi sperimentali come la coltivazione a basso costo, un numero elevato di progenie e accessibilità genetica. L'ultimo punto è di particolare rilevanza per la costruzione di trasformanti che permettono di indagare l'importanza dei geni so-far non caratterizzate per diversi meccanismi cellulari. Funghi filamentosi sono stati strumentali per la delucidazione di diversi elementi e meccanismi di controllo della qualità vie cellulari come attività della proteasi per la degradazione delle proteine ​​aberranti, dinamiche mitocondriali per mantenere l'integrità mitocondriale e autophagy per la rimozione di eccedenza e / o componenti cellulari disfunzionali e per mantenere vitalità cellulare in tempi di fame ^1,2,3.

Ci sono diverse tecniche sperimentali disponibili per lo studio dell'autofagia in filamentose funghi ^2: (i) ricerca di vacuoli if contengono organismi autofagiche densi quando proteasi sono inibiti mediante microscopia elettronica a trasmissione ^4, (ii) visualizzazione di autophagosomes monitorando GFP-Atg8 foci tramite microscopia a fluorescenza ^5,6 e (iii) il rilevamento di strutture autophagosomal acidificati utilizzando il colorante fluorescente monodansyl cadaverina ^7.

Qui, un nuovo metodo di coltivazione Penicillium chrysogenum per studi autofagia è presentato. L'elemento principale è il 'pad fame' che consiste semplicemente di 1% agarosio disciolto in acqua di rubinetto sterilizzata. Composti aggiuntive (ad esempio, stress, spazzini, modulatori autofagia) possono essere aggiunti al pad fino a quando non visualizzano auto-fluorescenza. Il pad si trova in vetrini contenenti una cavità centrale superficiale. Questo pad in inoculati sia con una sospensione di spore o con piccoli frammenti di micelio. Quest'ultimo è consigliabile se il ceppo di interesse non sporulate in modo efficiente (ad esempio, i ceppi atg1 Δ ^8). I vetrini sono posizionati in camere umide (questi possono essere facilmente costruiti utilizzando scatole di tip pipetta vuote) per prevenire l'essiccamento del campione e incubate a temperatura ambiente. P. chrysogenum è in grado di crescere per alcuni giorni in queste condizioni. L'autofagia può essere osservato al microscopio dall'allargamento vacuolar che è un indicatore positivo per autofagia fungine. In questo contributo, una P. chrysogenum ceppo (Wisconsin 54-1255) viene utilizzato, che costituisce la proteina fluorescente verde, che si rivolge a perossisomi per la sua sequenza di ⁹ C-terminale 'SKL'. Pertanto è possibile monitorare la degradazione dei perossisomi. E 'fattibile etichettare anche altri compartimenti della cellula (ad esempio, mitocondri) utilizzando segnali di localizzazione appropriati ed analizzare la loro degradazione. Anche se i dati di P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) è presentato qui, è certamente possibileper utilizzare il metodo 'pad fame' anche per altri funghi filamentosi (es Neurospora crassa, Sordaria macrospora, specie di Aspergillus, etc.).

Protocol

1. Preparazione di P. chrysogenum per gli esperimenti da fame Se la P. chrysogenum ceppo di interessi è tenuto il riso ('riso verde'), posizionare 2-3 chicchi di riso ricoperti di sporulanti micelio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Riempire con 500 microlitri YGG (10 g / l KCl, 20 g / l di glucosio, 10 g / l di lievito base di azoto, 5 g / l K 2 HPO 4 estratto di lievito, 20 g / l). Agitare la provetta per 30 sec in modo che le spore possano …

Representative Results

Per dimostrare l'utilità del protocollo sopra descritto degrado perossisoma nel P. chrysogenum ceppo Ws54-1255 (GFP-SKL) è stato analizzato. In questo ceppo GFP-SKL è di solito importato in perossisomi 9. Ciò provoca la comparsa di molteplici forme sferiche quando il campione viene analizzato tramite microscopia a fluorescenza. Se si verifica l'autofagia, vacuoli ingrandire. GFP-SKL viene incorporato nel vacuoli da autofagia (pexophagy). A causa del fatto che la GFP è resistente alla deg…

Discussion

Il metodo qui presentato permette lo studio comoda e riproducibile dell'autofagia in P. chrysogenum. Ad esempio, può essere utilizzata per lo screening l'efficacia di vari composti che siano in grado di modulare la risposta autofagia di questo fungo o meno. I risultati con rapamicina dimostrano che l'inibizione di segnalazione TOR conduce ad una induzione pronunciato dell'autofagia in P. chrysogenum che è stato dimostrato anche per altri organismi ^11.

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Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 – 0.50 mm