Otofaji Analiz<em> Penicillium chrysogenum</em> Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak
Summary
A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.
Abstract
The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.
Introduction
İpliksi mantar gelişme işlemine çalışma için mükemmel bir model sistemleridir. Bunlar ucuz ekimi, döl ve genetik erişilebilirlik yüksek sayılar gibi birçok deneysel faydaları sunuyoruz. son nokta, çeşitli hücresel mekanizmalar için çok-çok uncharacterized genlerin önemini araştıran izin Transformantların yapımı için özellikle önemlidir. İpliksi mantar fazlası ve / veya işlevsel hücre bileşenlerinin çıkarılması için mitokondriyal bütünlüğü ve Otofaji sağlamak ve sürdürmek için çeşitli elemanlar ve anormal protein, mitokondriyal dinamikleri indirgenmesi için proteaz aktivitesi hücresel kalite kontrol yollarının mekanizmaların açıklanması için etkili olmuştur açlık 1,2,3 zamanlarında hücre canlılığı.
Ipliksi mantarlar 2 Otofaji çalışma için uygun bir çok deneysel teknik vardır: vaküol (i) inceleme ıproteazlar, transmisyon elektron mikroskopisi 4 tarafından önlendiği zaman f de yoğun otofajik organları içeren, (ii) flüoresan boya monodansyl kadavenn kullanılarak floresan mikroskop 5,6 ve asidifiye autophagosomal yapıları (iii) algılama ile GFP Atg8 odak izleyerek autophagosomes görselleştirme 7.
Burada, otofaji çalışmaları için penicillium chrysogenum büyüyen yeni bir yöntem sunulmaktadır. Ana unsur sadece agaroz sterilize musluk suyunda çözünmüş 1% oluşur 'açlık pedi' olduğunu. Ek bileşikler (örneğin, stres, temizleyiciler, otofaji modülatörleri) sürece otomatik floresan göstermez altlığınızda ilave edilebilir. ped sığ merkezi boşluğu ihtiva mikroskop slaytlar yer almaktadır. Bir spor süspansiyonu ile ya da küçük miselyum fragmanları ile aşılanır Bu ped. ilgi suşu sporulat başarısız olursa ikinci tavsiye ediliretkin bir şekilde, e (örneğin, Δ atg1 suşları 8). slaytlar numunenin kuruma önlemek için (bunlar kolayca boş pipet ucu kutuları kullanılarak inşa edilebilir) ve oda sıcaklığında inkübe ıslak odalarında konumlandırılmış. P. chrysogenum, bu koşullar altında bir kaç gün için büyümeye edebilmektedir. Otofaji mantar Otofaji için olumlu bir belirtecidir vakuolar genişleme ile mikroskobik edilebilir. Bu katkı, bir P. chrysogenum soyu (Wisconsin 54-1255) C-terminal 'SKL' dizisi 9 ile peroksisomlara hedeflenen yeşil floresan proteini oluşturan kullanılır. Bu nedenle, peroksizom bozulmasını izlemek mümkündür. Uygun lokalizasyon sinyallerini kullanarak, aynı zamanda hücrenin (örneğin, mitokondriya) 'in diğer bölmeleri etiket ve bozunmasını analiz etmek mümkündür. P. veri rağmen chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) kesinlikle mümkün, burada sunulmuşturDiğer ipliksi mantarlar için de 'açlık ped' yöntemi kullanmak (örneğin, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus türleri, vb).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntem, P. otofaji uygun ve tekrarlanabilir çalışma sağlar chrysogenum. Örneğin, bu mantar ya da değil Otofaji tepkisini modüle edebilen olup çeşitli bileşiklerin etkinliğini taramak için kullanılabilir. rapamisin ile sonuçlar Devri sinyallemesinin engellenmesi P. otofaji belirgin bir indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir chrysogenum, diğer organizmalar 11 kanıtlanabildiği.
Daha karmaşık mikroskoplar?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CQS receives a fellowship from the LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). The author would like to thank Ida J. van der Klei for the P. chrysogenum strains used in this work and Andreas S. Reichert for the gift of rapamycin.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 – 0.50 mm |
References
- Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
- Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
- Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
- Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
- Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
- Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
- Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
- Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
- Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
- Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
- Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
- Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, S110-S119 (2009).
