Analyse af Autophagy i<em> Penicillium chrysogenum</em> Ved hjælp Sult Pads i kombination med Fluorescence Microscopy

Summary

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Abstract

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introduction

Filamentøse svampe er fremragende modelsystemer til studiet af udviklingsprocesser. De tilbyder flere eksperimentelle fordele som billig dyrkning, høje antal afkom og genetisk tilgængelighed. Det sidste punkt er især relevant for opførelsen af ​​transformanter, der tillader undersøger betydningen af ​​såkaldte langt ukarakteriserede gener for forskellige cellulære mekanismer. Trådsvampe har været medvirkende til belysning af flere elementer og mekanismer i cellulære kvalitetskontrol veje som protease aktivitet for nedbrydning af afvigende proteiner, mitokondrie dynamik for opretholdelse mitokondrie integritet og autophagy til fjernelse af overskud og / eller dårligt fungerende celle komponenter, og for at opretholde celle levedygtighed i tider med sult ^1,2,3.

Der er flere eksperimentelle teknikker til rådighed for studiet af autophagy i trådsvampe ^2: (i) undersøgelse af vakuoler if de indeholder tætte autophagic organer, når proteaser inhiberes af transmissionselektronmikroskopi ^4, (ii) visualisering af autophagosomes ved at overvåge GFP-Atg8 foci via fluorescensmikroskopi ^5,6 og (iii) påvisning af syrnede autophagosomal strukturer ved hjælp af fluorescerende farvestof monodansyl cadaverin ^7.

Her er en hidtil ukendt fremgangsmåde til dyrkning af Penicillium chrysogenum for autophagy undersøgelser præsenteres. Det vigtigste element er den "sult pad", som blot består af 1% agarose opløst i steriliseret vand fra hanen. Yderligere forbindelser (f.eks stressfaktorer, scavengers, autophagy modulatorer) kan tilsættes til puden, så længe de ikke udviser auto-fluorescens. Puden er placeret i mikroskopobjektglas, der indeholder en lavvandet centralt hulrum. Denne pude i podet enten med en sporesuspension eller med små mycelium fragmenter. Sidstnævnte er tilrådeligt, hvis stamme af interesse ikke sporulate effektivt (f.eks Δ atg1 stammer ^8). Objektglassene anbringes i våde kamre (disse kan let konstrueres ved anvendelse af tomme pipette tip bokse) for at forhindre udtørring af prøven og inkuberes ved stuetemperatur. P. chrysogenum er i stand til at vokse i et par dage under disse betingelser. Autophagy kan observeres mikroskopisk ved vakuolær udvidelse, som er en positiv markør for svampe autophagy. I dette bidrag en P. chrysogenum stamme (Wisconsin 54-1255) anvendes der danner grønt fluorescerende protein, der er målrettet til peroxisomer ved sin C-terminale "SKL 'sekvens ^9. Derfor er det muligt at overvåge nedbrydningen af ​​peroxisomer. Det er muligt også at mærke andre rum i cellen (f.eks mitochondrier) ved anvendelse af passende lokaliseringssignaler og analysere deres nedbrydning. Selvom data fra P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) præsenteres her, det er bestemt muligttil også at bruge den "sult pad 'metode til andre trådsvampe (fx Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus arter, etc.).

Protocol

1. Fremstilling af P. chrysogenum for sult Eksperimenter Hvis P. chrysogenum stamme af renter holdes på ris (»grønne ris«), placere 2-3 riskorn dækket med sporulerende mycelium i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fyld den med 500 pi Ygg (10 g / l KCl, 20 g / l glucose, 10 g / l gærnitrogenbase, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l gærekstrakt). Vortex røret i 30 sek, således at sporerne kan løsnes fra ris effektivt. Inkubér rør i 1 dag ved stuetempera…

Representative Results

For at demonstrere anvendeligheden af protokollen beskrevet ovenfor peroxisome nedbrydning i P. chrysogenum stamme Ws54-1255 (GFP-SKL) blev analyseret. I denne stamme GFP-SKL normalt importeres til peroxisomer 9. Dette resulterer i forekomsten af ​​flere sfæriske former, når prøven analyseres via fluorescensmikroskopi. Hvis autophagy sker, vakuoler forstørre. GFP-SKL bliver inkorporeret i vakuoler ved autophagy (pexophagy). På grund af det faktum, at GFP er resistent over for nedbrydning af …

Discussion

Den præsenteres her metode gør det muligt praktisk og reproducerbar undersøgelse af autophagy i P. chrysogenum. For eksempel kan den anvendes til screening af virkningen af ​​forskellige forbindelser, om de er i stand til at modulere autophagy reaktion af denne svamp eller ej. Resultaterne med rapamycin viser, at inhibering af TOR signalering fører til en udtalt induktion af autophagy i P. chrysogenum som også er blevet påvist for andre organismer ^11.

D…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 – 0.50 mm