Functionele en morfologische beoordeling van Diafragma Innervatie door diafragma Motor Neuronen
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) is een slopende motor neuron ziekte die is geassocieerd met het verlies van zowel de bovenste en onderste motorische neuronen en daaropvolgende spierverlamming. Bij de diagnose, overleving van de patiënten gemiddeld slechts 2-5 jaar 1. Diafragma motor neuron (Phmn) verlies is een cruciaal onderdeel van de pathogenese van ALS. Patiënten uiteindelijk sterven als gevolg van het verlies van Phmn innervatie van het diafragma, de belangrijkste spier van inspiratie 2,3. Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) is ook een ernstig probleem met bijbehorende ademhalingsmoeilijkheden. Ongeveer 12.000 nieuwe gevallen van SCI zich elk jaar 4 als gevolg van traumatische beschadiging van het ruggenmerg. Ondanks ziekte heterogeniteit wat locatie, het type en de ernst, de meeste gevallen gaat SCI trauma aan het ruggenmerg, wat vaak leidt tot slopende en persistent respiratoire compromis. Naast ALS en SCI, andere centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten geassocieerd wet middenrif respiratoire dysfunctie 5,6.
Het diafragma zenuw is een efferente motorische zenuw die de ipsilaterale hemi-diafragma innerveert en dat afkomstig is uit Phmn cellichamen zich in het C3-C5 niveaus van de ipsilaterale cervicale ruggenmerg. Phmn uitgang wordt bestuurd door aflopende bulbospinal input van de hersenstam in een gebied dat bekend staat als de rostral ventrale respiratoire groep (rVRG) 7. De rVRG-Phmn-membraan circuit staat centraal in de controle van inspiratoire ademhaling, en andere niet-beademing membraan gedrag. Diverse traumatische letsels en neurodegeneratieve aandoeningen die deze circuits invloed kan leiden tot een diepe daling van de longfunctie en de patiënt de kwaliteit van leven. Oplopende input voor PhMNs van de rVRG, Phmn overleving, phrenicus integriteit en de goede innervatie bij het middenrif neuromusculaire junctie (NMJ) zijn noodzakelijk voor een normale diafragma-functie. Het is daarom belangrijk om technieken gebruiken diekunnen kwantitatief evalueren van dit circuit in vivo in knaagdiermodellen van ALS, SCI en andere CNS ziekten.
Met dit protocol, het doel is experimentele hulpmiddelen beschrijven voor het beoordelen Phmn innervatie van het diafragma op zowel elektrofysiologische en morfologische niveau. Compound spier actiepotentialen (Cmappen) worden geregistreerd door het stimuleren van alle efferente motor neuron axonen van een bepaalde motorische zenuw en vervolgens analyseren van de uitgelokte depolarisatie reactie van de doelgroep myovezels. Deze techniek kan in vivo in verdoofde ratten en muizen functionele innervatie van de hemi-membraan door PhMNs 8 kwantificeren. Vanwege het feit dat Cmappen vertegenwoordigen gelijktijdig opnemen van alle (of althans veel / de meeste) spiervezels van de gehele hemi-membraan, is het nuttig om ook de fenotypen van afzonderlijke motor axonen en spiervezels in het membraan NMJ onderzoeken om ziekte te volgen – en therapie-relevante morfologische veranderingen, zoals gedeeltelijke en complete denervatie, regeneratieve kiemen en reïnnervatie. Dit kan worden bewerkstelligd via whole-mount immunohistochemie (IHC) van het membraan, gevolgd door een gedetailleerde morfologische beoordeling van individuele NMJs gehele spier 9. De combinatie Cmappen en NMJ analyse biedt een krachtige aanpak voor het kwantitatief bestuderen middenrif innervatie in knaagdiermodellen van de ziekte CNS en PNS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als ademhaling is aangetast in zowel traumatische SCI en ALS, het ontwikkelen van therapieën die de ademhaling en in het bijzonder het middenrif innervatie richten zijn klinisch relevant 5,6. Om uitvoerig bestuderen respiratoire functie, moet een gecombineerde aanpak methode worden gebruikt. Cmappen meten de mate van functionele innervatie van het membraan door middel van externe phrenic zenuwstimulatie, maar niet endogene bulbospinal luchtwegen schijf 8. Bovendien hebben deze opnamen niet mogelij…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
